miR-214調控的凋亡在肝纖維化中的作用

劉立朋，張秀利，張秀英*

(1.首都醫科大學 人體解剖與組織胚胎學系，北京100069；2.吉林大學中日聯誼醫院 新民胸外科)

細胞凋亡(apoptosis)對維持機體正常生理功能起到重要作用[1]。有文獻揭示Bim可通過其下游蛋白導致線粒體膜上Bax/Bak發生寡聚化[2]，引起線粒體膜的通透性改變，釋放細胞色素C(cyt C)，激活凋亡蛋白 Caspases(如Caspase-3)誘導細胞凋亡[3]。同時有文獻指出，miR-214 可以抑制骨肉瘤細胞及過氧化氫誘導的心肌細胞的凋亡[4,5]。本研究旨在探討miR-214調控的凋亡在肝纖維化小鼠中的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1C57BL/6 小鼠(動物許可證號:SCXK2012

0001)于維通利華公司購買，小鼠為雄性，體重18-22 g，6周齡，SPF級，于首都醫科大學動物房規范化飼養。

1.1.2主要試劑 H&E試劑盒，天狼猩紅試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)； miR-214 agomir negative control，miR-214 agomir由北京歐林格生物科技有限公司合成；RNA 提取試劑Trizol；鼠抗α-SMA單克隆抗體(sigma)；兔抗Caspase-3單克隆抗體(CST)；羊抗兔 IgG-HRP，羊抗鼠 IgG-HRP(CST)；micro-RNA 逆轉錄試劑盒(Taqman)；PVDF 膜 (Merck Millipore)；ECL發光液(Bio-red)。

1.2 方法

1.2.1肝纖維化動物模型制作 24只6周齡雄性 C57BL/6 小鼠(北京維通利華實驗動物有限公司)，以每組12只隨機分為兩組。實驗組采用四氯化碳腹腔注射誘導肝纖維化，以1∶9的比例將四氯化碳溶于橄欖油中，按體重給予1 mL/kg，每周兩次，進行腹腔注射，對照組僅用橄欖油進行腹腔注射。四氯化碳注射6周時，采用尾靜脈注射方式，對照組注射 miR-214 agomir negative control ，實驗組注射 miR-214 agomir每周注射一次，每次 1 nmol，共注射兩周。待造模8周時對小鼠進行取材，部分肝組織放于 10% 福爾馬林溶液中用于石蠟包埋進行形態學染色；部分組織存放于-80℃超低溫冰箱用于 Western blot；……