白血病患者ID4、WT1、GLIPR1基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化及mRNA表達(dá)的研究

崔桂榮,李 焱,賈振薇，張金華

(邯鄲市第一醫(yī)院 血液內(nèi)科,河北 邯鄲056002)

DNA甲基化(methylation)作為最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑一直屬于生命科學(xué)的前沿課題之一，其能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)[1]。研究顯示[2]：白血病抑癌基因啟動(dòng)子異常甲基化與白血病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化抑制相關(guān)mRNA的表達(dá)水平可能為白血病發(fā)病的重要分子機(jī)制。本研究采用甲基化特異性PCR(MS-PCR)及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(RT-QPCR)對(duì)ID4、WT1、GLIPR1抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及相關(guān)mRNA進(jìn)行了檢測(cè)，旨在探討白血病分子發(fā)病機(jī)制，為白血病防治提供臨床資料。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選擇2016年1月至2018年1月我院血液科就診的80例初診未治白血病患者為研究對(duì)象，其中男56例，女24例，年齡15-48歲，平均(34.3±11.6)歲，包括：急性髓系白血病(AML)34例、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)25例、慢性粒細(xì)胞白血病(CML)21例，白血病診斷及分型符合FAB診斷及標(biāo)準(zhǔn)；選取同期60例志愿者為對(duì)照組，男41例，女19例，年齡15-45歲，平均(33.3±10.7)歲，包括缺鐵性貧血48例，特發(fā)性血小板減少性紫癜12例。兩組在性別、年齡構(gòu)成上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 方法

兩組研究對(duì)象肝素抗凝取骨髓液2 ml，分離單個(gè)核細(xì)胞-80℃凍存行基因組提取。MS-PCR檢測(cè)ID4、WT1、GLIPR1抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)狀態(tài)，DNA/RNA抽提試劑盒購(gòu)自日本Ta Ka Ra公司產(chǎn)品；PCR引物由Invitrogen公司合成。反應(yīng)條件,ID4：94℃ 4 min；94℃ 30 s、45℃30 s、72℃45 s、30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；WTl ：94℃ 4 min；94℃ 45 s、58℃30 s、72℃45 s、40個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；GLIPRI：94℃ 5 min；94℃ 30 s、45℃30 s、72℃45 s、30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。甲基化特異性引物：ID4-MF：5′-TTTTATAAATATAGTTGCGCGGC-3′；ID4-MR：5′-GAATATCCTAATCACTCCCTTCGA-3′；WTl-MF：5′-TTTGGGTTAAGTT-

AGGCGTCGTCG-3′：WTl-MR：5′-ACACTACTCCTCGTACGACTCCG-3′；GLIPRl-MF：5′-TAAT-

TATATTTTTAGAAATTGCGGC-3′：GLIPRl-MR：

5′-ACTATTAATTTCACCTCTAATCGAA-3′。

RT-PCR檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)情況，人急性髓系細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60及慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562購(gòu)自珠江醫(yī)院，RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司。I……