人野生型S100A10原核表達載體的構建、蛋白表達純化及鑒定

王德利,尹顯貴，楊 華，李 赫

(1.吉林大學生命科學學院,吉林 長春130012；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊 第964醫院，吉林 長春130062； 3.吉林大學口腔醫學院，吉林 長春130021)

S100A10又被稱為p11，屬于S100家族成員，是一種鈣離子結合蛋白，在細胞內外發揮多種功能[1]，與膜聯蛋白A2(ANXA2)形成異源四聚體AIIt中被發現[2]。在生理狀態下AIIt定位在細胞的內膜及外膜上，其中外膜上的AIIt為纖溶酶原(plasminogen)和組織纖溶酶原激活劑(tPA)提供錨定位點[3]，是調控腫瘤細胞遷移與轉移的關鍵蛋白復合體，被認為是腫瘤治療的一個潛在靶點。有文獻研究表明，當S100A10與ANXA2形成復合體時，其半衰期增加，而在不與ANXA2結合時會被泛素化降解[4]，因而在細胞中的豐度較低，這為研究其功能帶來了困難。同時，由于S100A10同源二聚體結構的特性，其N端和C端都參與了AIIt的形成，即與ANXA2 N端的相互作用。因此，為了能進一步研究S100A10蛋白的功能及以其為靶點進行藥物篩選，我們利用大腸桿菌表達體系表達并純化了不帶有標簽的野生型S100A10蛋白，并通過Western Blot及ANXA2-GST融合蛋白pull-down實驗進行鑒定。

1 材料

菌株：DH5a感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；BL21(DE3)感受態細胞為本實驗室保存。

載體：pEXS-DH原核表達載體改造自pET-28a，為中科院生物物理所孫飛組惠贈。

DNA聚合酶fast pfu購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶和T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher Scientific公司。

S100A10鼠單抗購自Cell Signaling公司；ANXA2鼠單抗購自Santa Cruz公司；HRP標記的羊抗鼠二抗購自Pierce公司。

2 方法

2.1 野生型S100A10原核表達載體的構建

以人肝癌細胞HepG-2的cDNA為模板，設計以下引物：P11_F:5’-ccgCATATGCCATCTCAAATGGAACACGCC-3’(NdeI),P11_R:5’-ccgCTCGAGCCttaCTTCATGTGTACTACAAAA-

TAGTCATT-3’(XhoI)。其中在反向引物中人為加入了終止密碼子，確保翻譯后的蛋白質C端與野生型相同。……