DTT誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

周子薦,沈璐妍,劉遠(yuǎn)達(dá),全成實(shí)*

(1.吉林大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021;2.吉林大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系; 3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 胃腸營養(yǎng)及疝外科)

研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化療藥的敏感性與其細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有著十分密切的關(guān)聯(lián)[1]。在化療藥物的作用下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受到破壞，蛋白質(zhì)無法折疊或錯誤折疊，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[2]。DTT(二硫蘇糖醇)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑，可阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基的氧化，干擾PDI(二硫鍵異構(gòu)酶)在蛋白質(zhì)二硫鍵形成中的催化作用，導(dǎo)致錯誤折疊的蛋白大量堆集[3]，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。因此，本實(shí)驗選用DTT誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG44產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并進(jìn)行線粒體應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)、線粒體ROS水平和細(xì)胞凋亡蛋白檢測。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑與儀器人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG44，購于上海子實(shí)生物公司。二硫蘇糖醇(DTT)購自北京coolaber公司，Caspase-3 活性檢測試劑盒購自上海碧云天公司。GRP78蛋白抗體購自proteintech公司；CHOP購自abcam公司；β-actin、PDI、HSP10、HSP60、ClpP、LON、Htr A2/Omi抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購自Santa Cruz公司。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 細(xì)胞培養(yǎng):使用10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持飽和濕度。細(xì)胞培養(yǎng)每3天進(jìn)行一次傳代，細(xì)胞使用0.01M PBS沖洗一次，0.25%胰酶細(xì)胞消化，并按照1∶3的比例進(jìn)行傳代。藥物處理：取對數(shù)期生長細(xì)胞，設(shè)置空白對照組和實(shí)驗組，實(shí)驗組采用DTT(5 μmol/ml)分別處理3 h，6 h，12 h及24 h。

1.2.2MTT比色法檢測 96 孔板接種為1.0×104細(xì)胞/孔，細(xì)胞用含10%小牛血清的正常培養(yǎng)液混勻，每孔終體積為100 μl，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育過夜。……