MiRNA210通過NUPR1基因靶向調控喉癌多藥耐藥性的研究

何 丹，王 蘋，李亞純，尹萬忠

(吉林大學第一醫院 耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春130021)

miRNA是真核生物中一類長度約為22個核苷酸的參與基因轉錄后水平調控的非編碼小分子單鏈RNA，能通過與靶特異性的堿基配對引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯，從而對基因進行轉錄后的表達調控[1,2]。miRNAs與腫瘤的多藥耐藥密切相關[3]，miRNA表達的改變可影響腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。miRNA在腫瘤的多藥耐藥中與其作用的靶基因組成了一個復雜的網絡調控腫瘤的多藥耐藥性。本實驗擬研究miRNA210及其靶基因在喉癌多藥耐藥中的作用。

1 材料和方法

1.1實驗試劑RPMI1640培養基、胎牛血清、Trizol試劑購于Invitrogen公司，miArrestTMmiRNA210 inhibitor Expression Clone慢病毒表達載體購自廣州復能基因公司。雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。合成質粒HTRA1、NUPR1購自上海捷瑞公司。CCK8試劑盒購于碧云天生物技術研究所。

1.2方法

1.2.1構建熒光素酶報告基因載體驗證miRNA210的靶基因 合成我們前期研究中預測的miRNA210靶基因HTRA1、NUPR1 3’UTR序列，篩選并購買雙熒光素酶報告基因質粒pmirGLO，轉化、小量搖菌、小提質粒，將質粒郵寄上海捷瑞公司，將3’UTR序列插入到pmirGLO中。合成質粒HTRA1、NUPR1。購買miR210表達載體、 miR210抑制物載體，及相應的空載質粒對照，質粒提純并備用。報告基因質粒HTRA1、NUPR1與miR210表達質粒及對照共轉染293T細胞，轉染48小時后提取細胞裂解液并用于熒光素酶檢測，應用PROMEGA雙熒光素酶檢測試劑盒檢測螢火蟲及海腎熒光素酶活性。將NUPR1載體做定點突變，測序，比較突變后miRNA210能否抑制其表達。

1.2.2miRNA210抑制物質粒對喉癌多藥耐藥表型的改變 復蘇耐藥細胞Hep-2v。……