肝細胞癌(HCC)門靜脈癌栓(PVTT)形成的分子機制研究進展

伊陳禾(綜述) 楊 鑫 王翔宇 朱 迎 李建華 許 達 賈戶亮 陳進宏△(審校)

(1復旦大學附屬華山醫院普外科 上海 200040; 2復旦大學腫瘤轉移研究所 上海 200040)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)(以下簡稱肝癌)是最常見的惡性腫瘤之一,發病率在惡性腫瘤中居第6位,死亡率居第3位,而每年近半數的新發和死亡病例在中國[1]。肝癌患者常常合并門靜脈癌栓(portal vein tumor thrombus,PVTT),據臨床資料顯示其發生率為31.4%～34.0%[2],在尸檢中更高,為44.0%～62.8%[3-4]。肝癌合并PVTT是影響肝癌患者預后的重要危險因素之一[5-6]。肝癌患者一旦出現PVTT,病情發展迅速,短時間內即可發生肝內外轉移、門靜脈高壓癥、黃疸和腹水,如果不及時治療,患者中位生存期將小于6個月[7],預后極差。因此,尋找PVTT的有效干預措施對于改善預后具有重要意義。PVTT形成的分子機制目前仍不清楚,本文從HCC自身改變和腫瘤微環境對PVTT形成的分子機制進行綜述。

腫瘤細胞自身改變對PVTT的影響

基因表達譜的改變 肝癌細胞中某些基因表達譜改變會影響腫瘤細胞的生物學行為而導致PVTT的發生。通過轉錄組測序分析發現,僅在PVTT中發生突變的基因包括KDM6A、CUL9、FDG6、AKAP3和RNF139,這些基因可能有助于HCC侵襲[8]。HCC與PVTT之間差異表達基因主要和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)受體相互作用途徑(ECM-receptor interaction pathway)相關,如PVTT組織中膠原型基因(如COL3A1、COL4A4、COL5A1、COL5A2、COL6A2和COL11A1)下調2～60倍。在PVTT樣本中,ARID1A-GPATCH3、MDM1-NUP107、PTGES3-RARG、PRLR-TERT和C9orf3-TMC1發生基因融合,RPS24基因發生外顯子跳躍的概率較高[9]。此外,CDK16在肝癌細胞中促進腫瘤細胞增殖、抑制細胞凋亡及誘導上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的過程中,其表達上調與PVTT有關[10]。神經氨酸酶-1(neuraminidase 1,NEU1)基因在HCC中高表達,通過影響剪接體的功能來促進HCC細胞的增殖和遷移,從而易形成PVTT[11]。此外,在肝癌細胞中染色體8p22-p23區域的ZDHHC2基因出現雜合性丟失,其表達降低會增加細胞增殖和侵襲能力,臨床病理顯示ZDHHC2的雜合性丟失與PVTT形成有關[12]。FOXP3不僅是Treg細胞的特征性標志物,其在腫瘤細胞中也有表達,表達程度和功能可能代表了一種新的腫瘤免疫逃避機制[13-14]。FOXP3基因的單核苷酸多態性與乙肝相關性HCC相關,且在rs3761549處CC基因型與PVTT形成有關[15]。

腫瘤細胞表觀遺傳學改變對PVTT的影響 表觀遺傳學(epigenetics)是在基因的核苷酸序列不發生改變的情況下研究基因表達的可遺傳的變化,包括DNA的甲基化、組蛋白的轉錄后修飾、染色質空間結構的改變和非編碼RNA的調控[16-17]。表觀遺傳的失調不僅在HCC發生中扮演重要角色[8,18-19],而且DNA甲基化與去甲基化和非編碼RNA調控對PVTT的形成起到重要作用。

DNA甲基化修飾被認為是一種重要的表觀遺傳沉默機制[20],在PVTT發展過程中起著重要作用。研究發現在HCC細胞中N-myc下游調節基因2(NDRG2)表達水平降低與啟動子高甲基化有關,NDRG2低表達易形成PVTT[21]。抑癌基因XAF1[22]和FAM83D[23]同樣在HCC中被高度甲基化,且臨床病理分析顯示其與PVTT的形成有關。在HBV感染相關的HCC中,HBV編碼的蛋白質X(HBx蛋白)被發現通過其轉錄激活特性上調DNA甲基轉移酶的表達[24],后者可介導某些抑癌基因甲基化,從而影響PVTT的發生[25]。原癌基因去甲基化會促進腫瘤的進展[20]。蛋白激酶人單極紡錘體1(human monopolar spindle 1,hMps1/TTK)基因啟動子的去甲基化會增加HCC中TTK的表達,TTK表達升高與PVTT呈正相關。進一步研究顯示TTK以p53依賴性方式激活Akt/mTOR和MDM2/p53途徑促進細胞增殖、遷移和生長,進一步促成HCC腫瘤和PVTT的發生[26]。

微RNA(microRNA,miRNA)是一類長17～25 nt的內源性單鏈非編碼RNA,是在細胞正常和病理狀態下重要的調控分子[27]。許多研究證實miRNA通過抑制其靶mRNA的表達來促進腫瘤生長、侵入、血管生成和免疫逃避,從而證明miRNA在腫瘤生物學中的重要性[28-29]。最近的研究發現某些miRNA與PVTT的形成密切相關。miR-135a在PVTT中顯著上調,同時體外和體內研究證實FOXM1轉錄調控miR-135a表達,并通過抑制轉移抑制因子Ⅰ的表達來促進肝癌細胞的侵襲,促進PVTT的形成[30]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)可通過影響miRNA來促進PVTT的形成[31]。HBV通過上調TGF-β活性,抑制microRNA-34a轉錄,從而促進CCL-22的表達,后者可募集Treg細胞誘導免疫逃逸,進一步促進肝癌細胞在門靜脈系統中的定植。EMT是上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程,也是癌癥轉移過程中重要的環節。miR-449a在PVTT組織中表達明顯減少,機制研究顯示miR-449a通過直接靶向抑制FOS和Met的表達來減弱EMT過程,從而抑制PVTT形成[32]。

長非編碼RNA(lncRNA)是一種由200到幾千個核苷酸組成的非編碼蛋白質的RNA[33]。lncRNA在不同的生物細胞過程(包括腫瘤發生發展)中發揮重要的調控作用[34-35]。比較PVTT和原發腫瘤的lncRNA表達譜,發現約有100個lncRNA的表達水平存在顯著差異,這些lncRNA可能在腫瘤轉移中發揮重要作用[36]。研究發現低表達lncRNA GAS5(grow arrest-specific 5)通過調節波形蛋白(vimentin)促進PVTT形成[37],此外,在表達細胞間黏附因子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)的腫瘤干細胞(tumor stem cell,CSC)中發現了一種新的高表達的lncRNA(ICAM-1相關的ICR)。ICR可以通過形成RNA雙鏈體來增加ICAM-1的mRNA的穩定性,從而上調ICAM-1的表達,進而調節ICAM-1陽性 HCC細胞的CSC的黏附能力來促進PVTT的形成[38]。

肝癌細胞表面黏附分子對PVTT的影響 細胞表面存在一些細胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAM),介導了細胞間或細胞與ECM間互相接觸和結合,在癌細胞脫離原發灶、移動并附著浸潤形成PVTT的過程中發揮著重要作用。這些CAMs包括鈣黏蛋白、免疫球蛋白超家族、選凝素及整合蛋白[39]。

鈣黏蛋白E-cadherin可維持細胞黏附性和極性,亦可在細胞間傳遞信息[40]。研究發現E-cadherin在形成PVTT的肝癌組織中表達量較未形成PVTT的癌組織中表達量顯著降低,E-cadherin使得肝癌細胞間黏附能力下降,易于從原發灶脫落,侵襲門靜脈分支,從而形成癌栓[41]。

免疫球蛋白超家族中ICAM-1在伴PVTT的HCC組織中顯著高表達[42],其可通過增加腫瘤細胞和血管內皮細胞之間的黏附力來促進肝癌細胞在門靜脈的轉移[43-44]。另一種免疫球蛋白超家族CD155是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白[45],是免疫細胞引發腫瘤排斥反應的重要配體[46]。PVTT的形成可能與CD155表達的喪失而導致HCC細胞的免疫逃逸有關[47]。

選凝素中E-選凝素(E-selectin)及其配體sLeX和sLeA在肝癌組織中高表達和PVTT的形成明顯相關,推測E-selectin結合肝癌組織表面sLeX和sLeA配體是PVTT形成的途徑之一[48]。

整合蛋白是細胞與ECM相互作用的關鍵介質,在存在ECM配體(例如膠原蛋白和層粘連蛋白)的情況下向細胞發送存活信號,并在其未結合狀態下誘導細胞的失巢凋亡[49]。EDIL3是一種肝癌細胞自分泌蛋白,在肝癌細胞轉移形成PVTT過程中與癌細胞表面整合蛋白αV結合通過FAK-Src-AKT信號通路抑制其失巢凋亡[50]。

肝癌細胞其他蛋白對PVTT形成的影響 肝癌細胞某些蛋白分子調節細胞的生物學特性可促進PVTT的形成。由神經纖維瘤病Ⅱ型腫瘤抑制基因(Nf2)編碼的merlin蛋白能夠調節細胞增殖、運動、存活和信號通路[51]。野生型Merlin(wtMerlin)通過限制HCC細胞的遷移和侵襲能力抑制PVTT形成,而缺乏外顯子2、3、4編碼序列的D2-4Merlin則通過誘導EMT過程和激活細胞干性基因來促進PVTT形成[52]。另外RPB結合蛋白(RPB-mediating protein,RMP)是RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,RNAP)第五亞基的調節蛋白,RMP可通過調節IL-6的轉錄來增強腫瘤起始細胞(tumor-initiating cell,T-IC)的自我更新能力,從而誘導EMT過程,促進PVTT的形成[53]。

腫瘤微環境對PVTT的影響HCC腫瘤微環境的改變為PVTT的形成提供不可缺少的條件,腫瘤微環境中的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)、趨化因子、低氧、Treg細胞、血管生長因子、凝血酶調節素(thrombomodulin,TM)以及載脂蛋白等與PVTT形成有關。

基質金屬蛋白酶 ECM是腫瘤侵襲轉移的組織學屏障[54]。MMP幾乎能降解ECM中的各種蛋白質成分,在腫瘤侵襲轉移中起到關鍵作用[55]。MMP-2和MMP-9在伴PVTT的HCC組織中明顯高于無PVTT者,推測PVTT形成與MMP-2和MMP-9降解ECM有關[56]。

趨化因子 趨化因子是一類能驅化細胞定向移動的小分子分泌蛋白質,由70～100個氨基酸組成,除了對免疫細胞有定向驅化作用外,還介導細胞的定向遷移,可能解釋肝癌細胞容易侵犯門靜脈的機制[57]。CXCR4是趨化因子CXCL12的受體,主要在細胞膜和細胞質中表達。在PVTT中CXCR4的表達水平顯著高于原發性肝癌組織。低表達CXCR4可以抑制PVTT細胞的轉移,推測CXCR4在PVTT形成過程中發揮重要作用[58]。趨化因子CCL15在肝癌樣本中過度表達,比較臨床病理結果發現其表達水平和腫瘤大小、PVTT形成和TNM分期有關,CCL15可能通過促進白細胞浸潤和調節腫瘤細胞運動促進癌癥的進展[59]。

低氧 低氧促進PVTT的形成[60]。低氧使腫瘤細胞14-3-3ζ和缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)增加:14-3-3ζ可以通過招募HDCA4來增強HIF-1α蛋白的穩定性,抑制HIF-1α乙酰化[61];而HIF-1α增加腫瘤細胞CCL20的分泌,后者招募單核細胞來源的巨噬細胞以CCL20依賴性方式誘導吲哚胺-2,3-雙加氧酶的表達,抑制T細胞增殖并促進免疫抑制性Treg細胞的擴增,形成一個免疫抑制的腫瘤微環境,促進PVTT的形成[60,62]。

血管生長因子 血管生長因子對腫瘤血管生成起到關鍵作用[63]。在對抗堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍化內皮細胞生長因子與肝癌微血管密度及PVTT形成的研究中發現,bFGF、VEGF、PD-ECGF對腫瘤血管形成具有協同作用,組織血管生長因子陽性表達數目越多,PVTT形成概率越高[64]。

凝血酶調節素 TM存在于癌細胞胞質及細胞表面,與PVTT密切相關,單發性腫瘤或無PVTT患者術前血漿TM水平明顯高于多發性肝癌患者或PVTT,提示低TM可能與肝內轉移和PVTT的形成有關[65]。TM陽性患者的肝內轉移頻率、PVTT發生率和包膜浸潤率均顯著低于TM陰性的患者。產生TM的HCC肝內擴散較慢,表明TM可能因抗凝血活性而抑制腫瘤細胞對門靜脈的黏附,從而減少肝內外轉移[66]。

載脂蛋白A1 載脂蛋白A1(apolipoprotein A-1,ApoA-1)作為高密度脂蛋白的主要蛋白成分,可抑制腫瘤血管生成[67],誘導抗腫瘤免疫微環境,限制腫瘤的進展[68]。在HCC患者血清中ApoA-1水平顯著降低[69-70],而在伴PVTT的HCC患者血清中ApoA-1水平更低[71]。ApoA-1可通過促進細胞周期停滯來抑制增殖和下調MAPK通路促進細胞凋亡;ApoA-1可能通過減弱腫瘤細胞降解ECM的能力來抑制PVTT的形成[72]。

結語肝癌合并PVTT是臨床治療中面臨的難點,嚴重影響患者預后。雖已證實腫瘤細胞自身改變(如基因表達譜、表觀遺傳和細胞分子等)和腫瘤微環境(MMP、趨化因子、低氧、Treg細胞、血管生長因子、TM和ApoA-1等)與PVTT的形成相關,但PVTT形成的機制尚不明確,需要進一步深入探索,以改善患者預后。