大鼠脊髓骶2節段損傷后脊髓DRD1表達的變化*

陳 瑩，張 向，田煥娜，陳 萌，吳曉光，任立群

（承德醫學院脊髓損傷與修復研究室，河北承德 067000）

痙攣是脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后一種常見并發癥，SCI后運動神經元對單胺類神經遞質的敏感性增高被認為是痙攣發生的一種重要機制。多巴胺(dopamine，DA)作為一種單胺類神經遞質，參與調節脊髓的運動、感覺等功能[1]。脊髓中的DA主要來源于下丘腦A11區的DA神經元[2]，通過與多巴胺受體（dopamine receptor，DAR）結合發揮作用。DAR包括D1樣受體（包括D1和D5）和D2樣受體（包括D2、D3和D4）兩種類型，其中的D1受體(dopamine receptor-1，DRD1)能介導運動行為等多種調節功能[3-4]。研究顯示[5]，脊髓完全橫斷后，芳香族氨基酸脫羧酶細胞能夠利用外源性左旋多巴合成DA，從而顯著增強運動神經元的興奮性，導致痙攣，但具體機制不清楚。本研究建立了大鼠第2骶髓（S2）水平全橫斷損傷模型，觀察SCI后大鼠尾部發生痙攣的情況和脊髓中DRD1表達的變化情況，以期為研究SCI后痙攣的發生機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組：健康成年雄性SPF級Wistar大鼠16只，體質量（180～220）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號為SCXK(京)2017-0001，適應性飼養一周后進行實驗。本研究通過承德醫學院實驗動物福利委員會許可，編號：NO.CDMULAC-2017-002。

1.1.2 實驗試劑及儀器：DRD1一抗，兔源性單克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司（NO.SC-14001）；熒光二抗Donkey anti- rabbit 594，購自美國Invitrogen公司。主要儀器：動物麻醉機和手術顯微鏡均購自中國深圳市瑞沃德生命科技有限公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，滑動式冰凍切片機購自德國Thermo Microm公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脊髓S2全橫斷損傷模型的制備：16只大鼠隨機等分為假手術組8只(Sham組)和SCI組8只。大鼠通過吸入異氟烷（2%～2.5%）持續麻醉，俯臥位固定、備皮，以第2腰椎棘突為中心，于后正中線做一長約4cm的切口，切開皮膚和肌肉，暴露第2腰椎椎板，用咬骨鉗緩慢咬除椎板，暴露第2腰椎對應的S2段脊髓，在手術顯微鏡下用顯微解剖鑷打開硬脊膜和脊髓蛛網膜，以不損傷脊髓背靜脈為前提，然后使用負壓吸引器將脊髓完全離斷1～3mm，在手術顯微鏡下仔細觀察，確保脊髓被完全橫斷，再逐層縫合[6]。Sham組：定位同上，只咬除椎板，保證硬脊膜完好無損傷。

1.2.2 SCI組大鼠尾部痙攣評分：SCI大鼠分別于術后2d、7d、14d、30d、60d，采用Bennett鼠尾痙攣評分法[7-8]進行尾部痙攣評分。

1.2.3 灌注取材與切片：大鼠術后60d尾部痙攣評分后，使用4%水合氯醛（0.7ml/kg）腹腔注射麻醉，固定后迅速打開胸腔，充分暴露心臟，先快速灌注300～500ml的0.9%生理鹽水將血液沖洗干凈，隨后灌注4%多聚甲醛300～500ml固定20～30min。灌注完成后Sham組和SCI組大鼠均取出S3-尾1節段脊髓，浸泡于4%多聚甲醛溶液中24h（4℃保存），然后放入30%蔗糖溶液中24～48h（4℃保存）。使用滑動式冰凍切片機將脊髓按照自上而下的順序連續切片，厚度40μm，用于免疫熒光染色[9]。

1.2.4 免疫熒光染色檢測DRD1的表達及數據統計：使用0.01mol/L PBS漂洗脊髓切片1次，10min；加入PBS-T（PBS液體中加入0.1% Triton）液體漂洗1次，10min；加入含5%驢血清的PBS-T室溫封閉1h，加入DRD1一抗（1：500）4℃孵育過夜；PBS-T清洗4次，每次15min（從此步驟開始需要避光操作）；加入Alexa Fluor 594標記的驢抗兔二抗（1：200）孵育1h；PBS清洗3次，每次10min；常規熒光封片。

全部脊髓切片所有區域拍照，保證曝光和通道條件相同，脊髓不同區域的照片采用Adobe Photoshop cs4軟件進行合成。合成后使用Image J軟件，首先轉化為灰階圖像，然后選定脊髓灰質的背角(dorsal horn，DH)、中間帶(intermediate zone，IMZ)和腹角(ventral horn，VH)三個區域，分析三個區域DRD1的光密度值。

1.3 統計分析 本實驗數據采用均數±標準差（±s）表示，通過SPSS 19.0軟件進行統計學處理，采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SCI大鼠尾部痙攣評分結果 SCI大鼠術后2d、7d、14d、30d、60d，尾部痙攣評分分別為0、1.10±0.28、1.32±0.85、2.50±0.53、4.15±0.36分。SCI大鼠術后不同時間點尾部痙攣變化見圖1：

圖1 SCI組大鼠不同時間點尾部痙攣的變化

2.2 SCI后大鼠脊髓骶尾段DRD1表達的變化 兩組大鼠脊髓骶尾段灰質DH、IMZ和VH區域均可見DRD1表達；Sham組大鼠脊髓灰質DH區域DRD1的表達比較弱，IMZ、VH區域DRD1的表達較強。SCI組大鼠脊髓灰質DH、IMZ和VH中DRD1表達的光密度值均明顯低于Sham組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見附表、圖2：

圖2 大鼠脊髓骶尾段DRD1的表達

附表 大鼠脊髓灰質不同區域DRD1光密度值（±s ，n=8）

附表 大鼠脊髓灰質不同區域DRD1光密度值（±s ，n=8）

分析區域 Sham組 SCI組 P DH 12.24±0.63 3.46±0.54 ＜0.05 IMZ 15.25±0.61 5.83±0.34 ＜0.05 VH 14.06±0.60 4.30±0.53 ＜0.05

3 討論

SCI是一種中樞神經系統創傷性疾病，SCI后可導致患者運動、感覺功能障礙，并且大多數SCI患者可出現明顯痙攣癥狀[10]，痙攣可導致關節攣縮、疼痛等，嚴重影響患者的生活質量，是當前國際上亟待解決的醫學難題。目前，用于SCI研究的動物模型主要有脊髓擊打損傷模型[11]、壓迫損傷模型[12]、脊髓半橫斷性損傷模型[13]和脊髓全橫斷模型[6]等。本研究使用脊髓S2全橫斷損傷動物模型，術后不會影響大鼠膀胱、腸道及下肢運動功能，僅導致大鼠尾部運動和感覺功能障礙；并且，這種模型造成的肌肉痙攣特征和持續時間與臨床上SCI患者近似，是理想的脊髓源性痙攣模型。Bennett等利用此模型，按照大鼠尾部痙攣特征將評分分為0～5分[7-8]。本研究發現，大鼠在術后5d內處于脊髓休克期，無痙攣反應，術后7d左右開始出現微弱痙攣表現，術后60d痙攣程度穩定不再變化。

目前，DRD1在脊髓中分布的研究較少。Zhu等運用實時定量PCR和原位雜交技術，發現DA所有受體亞型（D1-D5）的mRNA在小鼠脊髓腰段均有表達[14]；Kawamoto等也報道了相似結果[15]。Meneely等運用western blot方法，在小鼠脊髓腰段檢測出DRD1蛋白的表達[16]；但Barraud等應用原位雜交技術并未在非人類靈長類動物腰段脊髓中發現DRD1 mRNA的表達[17]。上述研究結果提示，不同種屬動物的脊髓中DRD1的表達不完全一致。本研究采用免疫熒光的方法，發現大鼠脊髓骶尾段灰質DH、IMZ、VH區域中均有DRD1的表達。

岳增輝等發現，腦卒中痙攣大鼠大腦皮質中DRD1 mRNA的表達明顯降低，針刺治療可使DRD1 mRNA的表達增高，并能明顯降低痙攣大鼠的的肌張力[18]。本研究亦發現，脊髓S2完全橫斷60d后，SCI大鼠尾部出現明顯痙攣癥狀，且脊髓骶尾段灰質中DRD1的表達顯著降低，提示SCI后DRD1低表達可能與痙攣的發生有關。本研究結果可為進一步研究SCI后痙攣的發生機制奠定基礎。