腎痿復方對糖尿病腎病大鼠腎組織MMP-9/TIMP-1表達的影響

鐘 霞，張宇韋，譚睿陟，樊均明，王 麗

（1西南醫科大學附屬中醫醫院中西醫結合研究中心，四川瀘州 646000;2成都醫學院）

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病的嚴重并發癥，目前已成為終末期腎病(ESRD)最常見的病因。其發展特點是腎小球基底膜增厚，胞外基質蛋白在腎間質和腎間質區擴增，最后發展為腎小球硬化、腎間質萎縮和纖維化并伴有腎功能障礙。多種生長因子、信號通路以及高血糖都會影響DN 中ECM 的合成和轉化率[1]。腎痿復方是本課題組從“腎痿學說”角度出發，以黃芪、三七為君藥制成，具有益氣補腎、活血化瘀的功效。此方已在臨床實踐中應用多年，對各種原因引起的慢性腎臟疾病有顯著療效。前期臨床研究表明在西醫治療基礎上，根據中醫辨證論治加入腎痿復方治療能有效改善糖尿病腎病患者的腎功能，提高患者的生存質量[2]。本研究擬通過應用腎痿復方干預后，觀察實驗組大鼠腎組織中纖維化和金屬蛋白酶指標的改變情況，初步探討腎痿復方防治糖尿病腎病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40 只SPF 級SD 大鼠，SPF 級，雄性，體重（180±20）g，由西南醫科大學SPF動物實驗中心提供（許可證：SYXK(川)2013-065）。

1.2 主要藥品、試劑、儀器

腎痿復方組成（黃芪50 g，三七10 g，當歸10 g，懷牛膝30 g，昆布30 g，牡蠣10 g，大黃6 g，丹參15 g，川穹15 g）購自西南醫科大學附屬中醫醫院；鏈脲佐菌素（STZ）購自美國sigma公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購于碧云天試劑有限公司（批號：C0105）；AB-PAS 染色試劑盒購于Solarbio 公司（批號：G1285）；ɑ-SMA 抗體購自ebioscience 公司（貨號：14-9760-82）；TGF-β1 抗體購自Cell Signaling Tech?nology 公司（貨號：3711S）；TIMP-1 購自Proteintech公司（貨號：10753-1-ap）；MMP-9抗體購自美國Bio?world Technology 公司（貨號：BS1241）；正置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；全波長酶標儀購自美國BioTek Synergy2；凝膠成像系統購自Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立

40 只雄性SD 大鼠，適應性喂養1 周后，隨機為正常對照組、糖尿病腎病組、腎痿復方低、高劑量組、每組10只，自由飲水和進食。正常組大鼠給予標準普通飼料喂養，模型組和實驗組大鼠高脂高糖飼料喂養8周后，禁食12 h，腹腔注射鏈脲佐菌素（strepto?zoticin，STZ）35 mg/kg(用pH=4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)建立糖尿病模型，正常對照組腹腔注射等容量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。5 d 后大鼠尾靜脈取血，將血糖≥16.7 mmol/L 視為糖尿病造模成功的標準。模型成功后第2 d開始灌胃，腎痿復方根據“動物與人體的公斤體重劑量則算系數表”換算，既低劑量=正常人每日給藥劑量÷人的重量×6.25，高劑量是低劑量的4倍，連續灌胃7 d。

1.3.2 標本采集

處死大鼠前1 d用代謝籠收集排泄24 h 的尿液，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉（300 mg/kg）將大鼠麻醉，腹主動脈取血，將樣本置于4 ℃的離心機中3 000 r/min離心10 min分離血清，檢測Crea、BUN 含量。部分腎組織用10%中性甲醛固定，常規脫水、透明及浸蠟包埋后HE和PAS染色法觀察腎臟形態學變化；部分腎組織凍存于-80 ℃冰箱，Western Blot 法檢測相應蛋白表達水平。

1.3.3 腎組織中α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1 表達含量測定

稱取0.05 g 腎組織，組織勻漿后測定總蛋白含量，取50 μg 蛋白進行SDS-PAGE 電泳，經PVDF 膜轉移后，用5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1一抗（稀釋比例1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3×5 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)偶聯二抗（稀釋比例1∶3 000）常溫孵育1 h，TBST 洗滌3×5min后，采用圖像分析系統檢測，結果以目標蛋白/內參灰度值表示。

1.4 統計學方法

實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，兩組組間比較采用t檢驗，方差不齊或不服從正態分布，先將數據轉換，若方差仍不齊，則用非參數檢驗；比較的對象大于兩組時，采用單因素方差分析（One-WayANOVA），P＜0.05 差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 一般情況觀察

正常對照組大鼠狀態良好，飼養期間無死亡現象。糖尿病腎病組大鼠均出現糖尿病典型多飲、多食、多尿、體重下降的表現；與正常對照組相比，糖尿病腎病大鼠出現皮毛無光澤，精神萎靡，反應遲鈍，一般活動明顯變差等表現，以模型組表現最為明顯。

2.2 腎痿復方對糖尿病大鼠生化指標的影響

24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮結果顯示：與模型組比較，腎痿復方低劑量、高劑量治療組大鼠24h 小時尿蛋白定量顯著下降，差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組相比，腎痿復方高劑量治療組血清肌酐、尿素氮水平均有所降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮結果

2.2 病理組織學結果

2.2.1 腎臟HE染色結果

正常對照組大鼠腎小球形態結構清楚，腎小球和基底膜基本正常，系膜區無增生，腎間質無纖維化及炎性細胞浸潤；模型組大鼠可見腎小球體積增大，基底膜增寬，系膜區明顯增生，出現彌漫性結節樣僵硬，結節周圍環形致密物沉積，腎小管上皮細胞脫落，出現空泡樣變性，管腔明顯擴張；腎痿復方低劑量組、高劑量組大鼠較模型組稍輕，見圖2。

2.2.2 PAS染色結果

正常對照組大鼠腎小球和腎小管結構基本正常，腎小球內紅染物質均勻分布，細胞外基質無堆積，系膜細胞無增生；模型組大鼠腎小球內陽性物質及系膜基質明顯增多，細胞外基質堆積，系膜細胞明顯增生，基底膜節段性增厚；腎痿復方低劑量組、高劑量組較模型組病變有不同程度減輕，見圖3。

圖2 腎臟蘇木精伊紅(HE)染色（×400）

圖3 腎臟PAS染色（×400）

2.3 Western Bolt結果

蛋白免疫印跡法顯示：正常組大鼠腎組織α-SMA、TGF-β、TIMP-1 蛋白水平呈低表達，MMP9呈高表達；而糖尿病腎病模型組大鼠α-SMA、TGF-β、TIMP-1蛋白水平顯著增高，MMP9蛋白表達降低；經腎痿復方干預后，低劑量組和高劑量組蛋白水平有不同程度改善，其中高劑量組尤甚，差異有統計學意義（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）。見圖4。

圖4 各組大鼠α-SMA、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1蛋白表達差異比較

3 討論

糖尿病腎病已成世界范圍內的一個主要健康問題，基礎科學和臨床治療都進行了大量的研究，雖然建立了治療策略,如適當的血糖控制,血壓控制和抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統等干預措施。盡管實施了這些策略，最終發展為終末期腎病的糖尿病患者數量仍然很高。因此，腎功能減退是糖尿病腎病研究的重點領域之一。糖尿病腎病的特征在于細胞外基質蛋白的過度沉積和腎小球濾過屏障的破壞。基質金屬蛋白酶（MMPs）影響細胞外基質蛋白的分解和轉換，表明MMP的表達改變可能導致糖尿病腎病[3]。臨床研究表明腎纖維化與長期的損傷和失調的正常傷口愈合過程與過量的細胞外基質沉積有關[4]。基質金屬蛋白酶是中性蛋白酶家族的成員，它們在腎小球ECM 降解和周轉的過程中起主要生理決定因素。而金屬蛋白酶組織抑制劑-1 作為MMP-9的抑制劑，可與其產生特異性結合影響糖尿病腎病中ECM的合成和轉化率，在腎臟疾病的病理生理學中起著重要作用[5]。無論損傷類型和病因，腎纖維化通常是進行性腎病的最終結局，并導致正常腎臟結構的嚴重破壞和伴隨的功能惡化[6]。TGF-β（轉化生長因子-β）被充分鑒定為腎纖維化的中樞介質，與糖尿病腎病中纖維化的發展廣泛相關。腎小管間質纖維化的潛在病理學的核心是上皮-間質轉化（EMT），或管狀上皮細胞向肌成纖維細胞的轉分化。該過程伴隨著許多關鍵的形態學和表型變化，最終導致細胞從管狀基底膜分離并遷移到間質中。最終，這些細胞作為活化的肌成纖維細胞存在，并進一步加劇纖維化狀態。大量證據支持TGF-β和下游Smad 信號傳導在腎纖維化的發展和進展中的作用，使其逐漸成為慢性腎臟病臨床進展的重要生物學標志和治療靶點[7]。

糖尿病中慢性腎病的最佳預防和治療需要實施特異性干擾糖尿病腎病發病機理的療法。糖尿病腎病的核心發病機制是虛、瘀、損；治療原則既是標本又是虛擬治療，治療方法是補體不足、活血、溫陽補腎；處方有黃芪健中湯、黨骨補血湯等[8]。研究表明黃芪可通過下調血清肌酐、血尿素氮及糖化血紅蛋白的含量發揮降低血脂、血纖維蛋白原、血液粘度，改善糖脂代謝，減少尿蛋白，延緩2型糖尿病腎病的癥狀[9-11]。三七及其活性成分可通過調節氧化應激、減輕炎癥、抗纖維化等途徑在糖尿病腎病中發揮防治作用[12-13]。臨床研究顯示當歸補血湯可改善患者腎功能，調節患者細胞因子和纖維化相關指標如單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)等的表達，具有抑制細胞因子聚集及延緩腎臟纖維化的作用[14]。當歸中藥復方可改善糖尿病引起的胰島素抵抗和周圍神經病變[15]。懷牛膝具有逐瘀通經、補肝腎、強筋骨、利尿通淋的作用[16]。小鼠體內實驗顯示牡蠣的有效成分牡蠣多糖能夠顯著促進巨噬細胞增殖和吞噬，能夠一定程度提高小鼠臟器系數和淋巴細胞增殖能力,提高變態反應強度，從而發揮免疫增強作用[17]。動物實驗表明大黃的主要成分大黃素及大黃酸具有改善腎功能、抑制腎張纖維化的作用[18-19]。丹參具有活血祛瘀，通經止痛，清心除煩，涼血消癰之功效，可降低糖尿病大鼠一氧化氮、內皮素的含量，對腎組織有顯著保護作用[20]。臨床研究證明川穹可降低白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-8（IL-8）的水平[21]。

4 結論

在大鼠DN 模型中，腎痿復方可能通過調節MMP-9/TIMP-1 信號轉導途徑比值的失衡，降低α-SMA、TGF-β1表達水平，改善糖尿病腎臟病理損傷，延緩糖尿病腎病進程，發揮腎臟保護作用。本實驗欠缺之處在于僅選用預實驗7 天起效的時間點，對血糖的影響還需長時間監測，后面有長期實驗進一步闡明其作用機理，為糖尿病腎病的臨床干預和治療提供新的理論和實驗依據。