病毒基因工程藥物研究進展

李遠遠，王鋆坦，李彩霞，徐鐘

(河南省科學院商業科學研究所，鄭州 450002 )

用活體微生物藥物治療細菌感染源于20世紀早期，微生物學家Felix d’Herelle利用噬菌體治愈痢疾，并開發出針對不同疾病的噬菌體載體藥物[1,2]，但噬菌體療法并不穩定，其光芒被隨后發現的第一種抗生素類藥物青霉素所掩蓋。與噬菌體藥物相比，抗生素類藥物性質穩定便于儲存和運輸、抗菌譜廣、免疫原性弱，具有更高的開發價值。近年來，隨著抗生素的廣泛使用，病原菌對抗生素的耐藥性越來越強，而新抗生素的發現變緩，亟需開發出替代抗生素治療的方案。病毒基因工程藥物最大的優勢是能夠自我繁殖，可以達到持續用藥的效果，以病毒為載體，通過對其效應物表達的調控，可以控制其給藥時間、部位及用藥量，實現精準用藥，減少藥物對正常細胞的毒副作用。我們將在本文中介紹以病毒為治療載體的藥物研究進展，比較不同病毒的特點，效應物分子的表達調控以及在疾病治療中的應用。

1 病毒載體藥物

病毒通過將遺傳信息整合到宿主細胞的基因組中，利用宿主細胞的復制和表達系統合成自身原件并殺死宿主。一些病毒具有腫瘤選擇性，例如M1病毒、細小病毒、牛痘病毒等，將這些病毒進行遺傳改造，以提高他們對癌癥細胞的選擇性和減少對正常細胞的毒性，用于腫瘤治療。以細菌為食的病毒被稱為噬菌體，噬菌體具有較強宿主選擇性，一種噬菌體能選擇性的消滅特定致病菌，一般采用裂解性噬菌體用于治療細菌感染，目前隨著多重抗生素耐藥超級細菌的出現，噬菌體療法越來越受關注。

1.1 噬菌體載體藥物

利用裂解性噬菌體對抗細菌感染源于Felix d’Herelle的研究，與抗生素不同，噬菌體種類繁多，病原菌對一種噬菌體產生抗性后能很快找到替代者。噬菌體療法在波蘭有較長的歷史，對該國的噬菌體療法評估結果顯示，153名攜帶耐藥性致病菌的患者中，40%患者癥狀得到改善，18%患者達到臨床康復標準[3]。在俄國，噬菌體療法是一種常規治療手段，各藥店都有Microgen制藥公司生產的各種抗感染的噬菌體非處方藥物出售[2]。自抗生素發現后，歐美國家放棄噬菌體療法，目前，隨著全球性的抗生素耐藥菌日趨嚴重，西方國家正加大噬菌體療法研究的投入，例如歐盟于2013年成立Phagoburn項目，開發治療燒傷的噬菌體療法[4]。

噬菌體是自然界中種類最多的生物體，從宿主菌豐富的環境中可以分離出各種對該細菌具有侵染作用的噬菌體[5,6]。但并非所有這些噬菌體都適于開發活體藥物，作為治療藥物的噬菌體需具備快速殺死宿主菌的能力，能夠侵染致病菌的各變異亞種，具有穩定的基因組，能快速繁殖，對pH變化穩定，易于包裝和長期儲存，不引起自身免疫反應等[7]。此外，由于噬菌體識別的細菌表面受體不同，一些噬菌體能夠侵染多種細菌(廣譜)，一些噬菌體只對特定的細菌具有殺滅作用(專一)，在感染病原菌的治療前，專一性噬菌體藥物的開發可采用逐步篩選的方法，以對一種噬菌體產生抗性的菌株為靶標，篩選出能侵染該菌株的新噬菌體，循環篩選，直到最后一輪產生的噬菌體抗性菌株對最初的噬菌體敏感，將這些噬菌體制成混合噬菌體藥物，用于治療耐多種噬菌體藥物的細菌感染[8]。

利用現代生物技術能夠快速鑒別和篩選出適于臨床治療的噬菌體。其中一種方法是用電子顯微鏡觀察噬菌體的形態，鑒別噬菌體種類，選取烈性噬菌體作為候選藥物，該方法同時可用于檢測噬菌體儲存藥物的質量[7]。另一種方法是基因組測序，通過噬菌體功能基因組分析，選擇適于疾病治療的噬菌體，能高效感染宿主菌的噬菌體有以下特點：1. 表達DNA依賴的RNA聚合酶，能快速復制，并抑制宿主菌的轉錄；2. 具有相對簡單的結構，不形成溶原狀態；3. 不含有基因整合酶和轉錄阻遏蛋白，為烈性噬菌體；4. 表達裂解酶和聚合物解聚酶，能有效識別和裂解宿主細胞[7]。

噬菌體進入人體后，會被體內天然和獲得性的免疫反應消除，這是影響噬菌體療法療效最主要的因素。有研究表明無論何種給藥方式，噬菌體都能進入人體循環系統，同時會降低人體對病原菌的天然免疫防御[9,10]，因此，每種用于免疫治療的噬菌體都需要進行免疫反應測試。為提高噬菌體療法的抗菌活性，用于臨床治療的每劑噬菌體藥物都含有多種噬菌體。此外，噬菌體的繁殖需要時間，在傳染性病原菌爆發時期，噬菌體療法的效果不顯著，需要以抗生素治療為主[11]。

為提高噬菌體藥物的藥效，通過分子生物學手段加強噬菌體對病原菌的裂解效果。噬菌體會產生促進細胞裂解的蛋白質，例如抑制肽聚糖合成的Amurins，降解肽聚糖的Endolysins和孔道蛋白Holins[12]，讓噬菌體攜帶外源裂解酶(例如Gp17和PlySs2)，以增強其的殺菌效果[13]。讓噬菌體攜帶感光劑tin(IV) chlorin e6 (SnCe6)，在紅光激發下殺滅靶細菌[14]。采用脂質體包埋的方法增長噬菌體在體內的半衰期，保證噬菌體到達病灶部位[15]。噬菌體對宿主具有較強選擇性，因此常規噬菌體療法對一些病人無效，為此Eliava研究所推出了個性化治療方案，用患者的病原菌，從噬菌體庫中篩選針對該病原菌的噬菌體藥物[16]，由于制備周期長，該藥物適用于慢性疾病(例如慢性胃腸疾病)的治療。針對耐藥性的病原菌，采用攜帶CRISPR/Cas基因編輯系統的噬菌體，對耐藥菌的抗性基因進行剪切，達到定向殺滅耐藥菌的目的[17,18]。細菌耐藥基因一般是質粒攜帶的，采用質粒依賴性的噬菌體，例如噬菌體PRD1，特異性的殺滅耐藥性的大腸埃希菌和沙門菌[19]。噬菌體與抗生素聯合用藥，能增強殺菌效果，例如噬菌體SBW25F2與卡那霉素聯合使用，能降低熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)耐藥性的出現[20]。

1.2 人源病毒載體藥物

病毒通過識別靶細胞表面受體進入細胞，選擇能進入特定人體細胞和組織的病毒作為載體，攜帶用于疾病治療的基因，能達到靶向治療的目的。目前，具有作為疾病治療的病毒載體有腺病毒相關病毒(AAV)、慢病毒、腺病毒、和豆病毒。

腺病毒相關病毒(AAV)屬于細小病毒科，需要借助輔助病毒(如腺病毒)完成復制。AAV是一種人類自身攜帶的非致病性病毒，不會對人體產生免疫反應[22]，因此可以直接用于體內細胞侵染，在細胞中可以以游離的形式存在，但具有較長的外源基因表達周期，通過AAV瞬時表達外源基因，是目前基因治療的標準方法。AAV最大的載容量為3kb，能夠浸染多種細胞和組織[21]。基于AAV載體的基因治療已經進入臨床應用。例如：世界上首個基因治療藥物阿利潑金(Glybera)，是由AAV1攜帶人源脂蛋白脂肪酶基因，通過肌肉注射治療脂蛋白脂肪酶缺乏遺傳病[23]，是目前最昂貴的藥物。由AAV2攜帶 RPE65(視網膜發色團異構酶)基因用于治療Ⅱ型先天黑蒙癥(LCA2)[24]，已經進入三期臨床試驗階段。此外，基于AAV治療血友病B、內風濕性關節炎、囊性纖維癥、無脈絡膜、肌肉萎縮、抗胰蛋白酶缺乏癥、重度心力衰竭和帕金森等疾病的基因藥物已經進入臨床試驗階段[25]。

慢病毒是一類潛伏期長的反轉錄病毒，具有較大的外源基因容量(18kb)，被廣泛用于基因治療。慢病毒載體在基因組上的整合位點相對隨機，較傾向于轉錄活躍區域，但病毒基因在基因組上的整合會引起甲基化或表觀遺傳修飾，因此外源基因的表達水平差別較大[26,27]。慢病毒載體常用于體外侵染細胞然后再植入體內，可用于造血細胞的轉導[25]。基于慢病毒載體的基因治療正進入臨床試驗，例如：攜帶β-球蛋白基因的慢病毒載體，用于治療β-地中海貧血癥[28]；攜帶脂肪酸轉運子編碼基因abcd1的慢病毒載體，用于治療X染色體連鎖的腎上腺腦白質營養不良(ALD)[29]；以及用攜帶效應基因的慢病毒載體治療慢性淋巴細胞白血病、B細胞急性淋巴細胞白血病和異染性腦白質營養不良等疾病[25]。

牛痘病毒載體具有較大的外源DNA容量，且無須整合到宿主基因組中，能通過血管傳播，因此能用于轉移性腫瘤的治療。攜帶粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-GSF)的牛痘病毒載體，對黑色素瘤、肝癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、胰腺癌和胃癌都具有療效[30,31]。利用只能在癌癥細胞中繁殖的人工牛痘病毒載體，攜帶黑色素合成基因-酪氨酸酶和酪氨酸酶相關蛋白合成基因，用于癌癥治療。被該病毒侵染的癌細胞將表達黑色素，利用黑色吸熱原理，用激光對腫瘤進行溫熱治療[32]。

腺病毒是雙鏈DNA病毒，宿主范圍廣，轉化效率高，且具有較大外源DNA容量，無須整合到宿主基因組中。但腺病毒具有較強免疫原性，能引起宿主較強的免疫應答反應，因此主要用作疫苗載體，例如：攜帶H5N1和H1N1抗原的腺病毒載體，口服用于預防H5N1和H1N1型流感病毒，臨床試驗結果顯示具有療效[33]。

2 病毒載體藥物的表達系統

微生物工程菌株應用于疾病治療時，其效應物分子表達的時間、空間和表達水平決定了該藥物的療效。例如，為增強病毒對腫瘤細胞的侵染效率，在病毒的外殼上表達能與腫瘤細胞結合的抗體亞基Fab或其它能與腫瘤細胞結合的多肽，保證病毒在腫瘤細胞中的富集，同時采用腫瘤或癌細胞特異的啟動子(端粒酶反轉錄酶啟動子hTERT，低氧誘導啟動子E2F-1和α-甲胎蛋白AFP啟動子等)調控效應物分子表達，保證藥物分子只在腫瘤細胞中表達[34]。為維持細胞內藥物與底物的平衡，采用底物誘導型啟動子調控效應物分子表達，例如用人工合成的脂肪酸誘導啟動子PPARα-TtgR表達減肥藥普蘭林肽，用于肥胖病的治療[35]。

為保證藥物分子能持續發揮療效，構建具有信號儲存能力的工程菌，可以在疾病信號分子瞬時表達過后，仍能起到持續治療作用。例如，采用噬菌體的位點特異性整合系統，該系統被信號分子觸發后，在基因特定位點發生重組，進而改變效應物調控系統的結構，達到組成型表達效應物分子的目的[36]，此外，還可以采用轉錄調控系統儲存信號，當效應物分子被觸發表達后，沒有誘導物的情況下也能持續表達[36]。為避免人體對外源效應物的免疫排斥，采用RNA等非蛋白類物質為效應物用于基因治療[37]。

3 結論與展望

天然病毒對其靶細胞具有殺滅作用，但作用強度及時效性無法控制，使其醫用價值受限。根據病毒對靶細胞的選擇性，以及病毒能作為DNA載體將外源基因轉移到宿主細胞中的特性，選擇特殊的病毒作為外源治療基因的載體，將具有疾病治療作用的分子導入特定的組織、細胞或細菌中表達，能達到靶向治療或定向殺菌的效果。該技術不僅可以用于遺傳疾病的基因治療，還能用于開發替代傳統化學藥物的活體微生物藥物，對醫藥發展具有重要的推動作用。

隨著新一代測序技術的快速發展，測序效率不斷提高以及測序成本的不斷下降，使得通過全基因組測序分析患者的基因缺陷成為可能，也為個性化基因治療奠定了基礎。但是出于安全性考慮和其天價的治療費用，目前大部分基因治療都處于動物試驗階段。全球首個基于AAV的基因治療藥物Glybera(治療脂蛋白脂酶缺陷癥)在歐盟上市3年后，出于成本的考慮于2017年10月退出市場[38]。2016年5月全球第二個基因治療藥物Strimvelis(治療腺苷脫氨酶ADA缺乏性重度免疫缺陷癥)在歐洲上市，Strimvelis基因治療，通過逆轉錄病毒(retrovirus)在體外將一個正常的ADA基因拷貝導入患者干細胞中，然后將修飾后的干細胞定植到患者骨髓，達到一次治療終生治愈的目的，極大的降低了治療費用[38]，盡管如此，但65萬美元的治療費用一般患者無法承擔。目前，熱門的新型生物技術CAR-T(嵌合抗原受體T細胞)療法與Glybera療法類似，通過體外改造人體T細胞，讓其攜帶識別特定腫瘤抗原的嵌合抗原受體基因，然后將修飾后的T細胞導入患者體內，用于白血病和腫瘤的治療[39]，由于CAR-T療法具有更廣的患者群體，其價格稍低于Glybera療法。目前有兩款CAR-T產品被美國FDA批準上市，Kymriah(2017年8月)用于治療急性淋巴細胞白血病和慢性大B細胞淋巴瘤，Yescarta(2017年10月)用于治療大B細胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，此外還有大量CAR-T產品處于臨床前試驗階段[39]。我國CAR-T產業發展迅速，自2017年12月起南京傳奇、上海明聚生物和上海恒潤達生等多家企業陸續申報了CAR-T 細胞臨床試驗。 2015年至今，我國CAR-T療法專利呈直線增長[40]。但目前CAR-T療法副作用明顯，國內外均出現多起CAR-T致死案例，因此CAR-T細胞構建方法及抗原靶點的選擇有待進一步優化，病毒基因載體技術的發展是其重要環節。

傳統化學藥物在人類的健康及農業發展史上具有重要作用，但是隨著化學農藥和抗生素的廣泛使用，農藥污染和抗生素耐藥性問題越來越突出，病蟲害的生物防治和抗生素替代療法逐漸受到重視。2015年美國開始采取抗生素替代計劃，逐步減少抗生素的使用，其中重要的舉措就是批準噬菌體制劑在食品和飼料添加劑中使用[41]，同時，國外許多藥企開始聚焦噬菌體療法的研發和推廣，例如：以色列一家微生物菌群治療公司BiomX2017年融資2400萬美元，開發定制的噬菌體療法用于根除痤瘡和炎癥性腸病相關的有害細菌；美國兩家初創公司AmpliPhi生命科技公司和Adpitive Phage治療公司都致力于開發代替抗生素治療的實用噬菌體治療方案。我國是抗生素濫用最為嚴重的國家之一，2016年國家開始實施細菌耐藥國家行動計劃(2016—2020)，逐步淘汰抗生素在飼料添加劑中的使用。近年來，噬菌體療法的研究發展迅猛，國內相繼成立了“國際噬菌體研究中心”(2014年11月)，“上海噬菌體與耐藥研究所”(2017年8月)，“國際噬菌體藥物研究中心”(2017年10月)，和“中英噬菌體合作研發實驗室”(2018年8月)。與西方國家相比，我國缺少參與噬菌體療法研究的大型藥企，這些大型藥企在噬菌體療法中的創新研究將極大推動我國噬菌體療法的發展。