梯度有序支架材料誘導神經干細胞的定向遷移

李夢媛, 李曉然, 戴建武, 文鐵橋

(1. 上海大學生命科學學院, 上海200444;2. 中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所納米-生物界面研究重點實驗室, 江蘇蘇州215123;3. 寧夏醫科大學回醫藥現代化教育部重點實驗室, 銀川750004)

脊髓損傷是中樞神經系統的嚴重創傷, 脊髓損傷后脊髓神經元大量缺失, 星形膠質細胞增生形成新的微環境, 分泌出基質細胞衍生因子-1α(stromal-cell-derived factor-1α, SDF1α)形成濃度梯度, 可長距離募集神經干細胞(neural stem cells, NSCs) 遷移到損傷部位[1]. 然而, SDF1α 在損傷部位濃度低且保留時間短, 導致神經干細胞不能形成足夠的群落實現神經網絡連接, 這是脊髓損傷修復效果不佳的原因之一[2]. 近年來, 已有學者通過注射、移植包載SDF1α 的活性材料到骨損傷[3]、心肌損傷[4]、軟骨損傷[5]等的損傷部位, 實現SDF1α 局部梯度濃度釋放, 可誘導自體干細胞遷移到損傷部位, 促進組織再生. 本工作采用靜電紡絲法制備放射狀膠原/聚己內酯(polycaprolactone, PCL)電紡纖維支架, 擔載具有膠原特異結合區的SDF1α, 制備得到膠原特異結合的SDF1α(collagen-binding domain SDF1α, CBD-SDF1α)梯度有序支架, 在進行神經干細胞培養后, 研究出此梯度有序支架材料對神經干細胞及神經干細胞球遷移能力的影響.

1 材料與儀器

1.1 材料和試劑

PCL (Sigma); 1, 1, 1, 3, 3, 3-六氟-2-異丙醇(Sigma); 胰酶替代物(Gibco); 表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)(Peprotech); 堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(Peprotech); B27(Gibco)等.

1.2 儀器

激光共聚焦掃描顯微鏡(A1RSi, 尼康); 場發射環境掃描電子顯微鏡(Quanta 400 FEG,美國FEI); CO2恒溫細胞培養箱(HERA cell i150, 賽默飛); 微量注射泵(KDS100, 美國KDS)等.

2 實驗方法

2.1 梯度有序纖維支架的制備

纖維支架溶質為膠原與PCL, 以3∶7 比例混合溶于六氟異丙醇(濃度比為20%). 固定靜電紡絲裝置, 接收裝置采用點電極與環形電極的組合[6]. 使用微量注射泵泵出膠原和PCL 的混合溶液, 控制其流速為0.15 mL·h?1, 控制高壓直流電源電壓為10 kV; 溶液噴頭距接收裝置的距離約為10 cm.

2.2 CBD-SDF1α 的制備

制備負載CBD-SDF1α, 大腸桿菌BL12(DE3)負載pET-CBD-SDF1α 質粒以表達CBDSDF1α 蛋白, 并用6×HIS 純化標簽純化和檢測[3].

2.3 支架材料孵育CBD-SDF1α

將膠原/PCL 纖維支架材料用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide; 1-hydroxypyrrolidine-2, 5-dione, NHS) 交聯后, 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS) 清洗3 遍. 支架材料在75% 的乙醇中浸泡2 h 消毒, PBS 清洗3 遍. 將500 μL 的CBD-SDF1α(0.5×10?6M)滴加在交聯后的支架材料上, 在37?C 培養箱中孵育2 h.

2.4 NSCs的分離培養

出生24 h 的美國癌癥研究所(Institute of Cancer Research, ICR)飼養小鼠斷頸處死后放入75%的乙醇中浸泡消毒, 在超凈工作臺中提取其大腦海馬區. 使用胰酶替代物在37?C 恒溫下消化分離的海馬區10 min, 然后將獲得的細胞重懸培養在無血清的DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)/F12培養基中,同時添加20 ng·mL?1bFGF、20 ng·mL?1EGF、B27、丙酮酸鹽和非必需氨基酸[7]進行NSCs 培養.

2.5 NSCs 的遷移

將NSCs 接種在材料外周, 使用貼壁培養基培養2 h (貼壁培養基：高糖DMEM/F12、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 和B27) 后, 更換分化培養基培養1 d (分化培養基:DMEM/F12 和B27). 在培養1 d 后, 用4% 多聚甲醛固定NSCs 20 min, 然后再用0.08%triton X-100 透膜5 min, 用5% 牛血清白蛋白(albumin from bovine serum, BSA) 封閉30 min. 將處理后的NSCs 樣品4?C 恒溫下孵育一抗12 h. 最后, 在室溫孵育二抗和4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4’, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)40 min 后, 使用激光共聚焦掃描熒光顯微鏡觀察拍照.

2.6 數據處理

數據的處理和計算采用Microsoft Office Excel 2007 軟件, 數據以“平均值± 標準差(X±SD)”的形式表示, 各指標組間差異采用t 檢驗法進行統計.

3 實驗結果

3.1 梯度有序纖維支架

圖1 為CBD-SDF1α 梯度支架材料圖. 如圖1(b)中的梯度有序纖維支架掃描電子顯微鏡圖(scanning electron microscope, SEM)所示, 利用靜電紡絲技術制備一種可同時提供有序纖維結構和梯度濃度生物信號分子的新型梯度材料. 該材料中心密度高, 外周密度低, 由此形成外周向中心逐漸增大的連續性密度梯度, 這種有序纖維結構可促進NSCs 遷移的接觸引導. CBD-SDF1α 孵育在制備好的支架材料上, 形成穩定結合的CBD-SDF1α 濃度梯度.CBD-SDF1α 是具有膠原特異結合性的基質衍生因子[8], 選用制備的材料中含有30%的膠原成分, 此支架材料可以與CBD-SDF1α 特異結合, 增大結合穩定性并且使CBD-SDF1α 存留時間更長, 可使其緩慢釋放[9]. 趨化因子受體4(chemokine receptor-4, CXCR4)是CBD-SDF1α的特異受體, 其強烈的趨化作用可促使NSCs 以及NSCS 遷移運動, 這將有利于NSCs 從CBD-SDF1α 低濃度區域向高濃度區域遷移.

圖1 CBD-SDF1α 梯度支架材料Fig.1 CBD-SDF1α embedded in the radially aligned electrospun fiber scaffolds

3.2 NSCs在梯度有序支架上的遷移

圖2 為有序梯度支架材料上NSCs 和NSCS 的遷移圖. 圖2(a)中, 將NSCs 種植在支架材料外周(紅色虛線右側)[10], 在貼壁培養2 h 后, 更換分化培養基培養1 d, 激光共聚焦掃描熒光顯微鏡拍照發現NSCs 沿著CBD-SDF1α 濃度梯度由低(材料外周)向高(材料中心)方向定向遷移. DAPI 染色觀察到部分NSCs 遷移至材料中心區域[11].

將體外增殖培養4 d 的NSCS 如上所述種植在支架材料外周, 在貼壁培養2 h 后, 更換分化培養基培養1 d 后觀察如圖2(b)中的DAPI 染色所示, NSCS 在遷移過程中由團聚狀態分散成單個細胞繼而沿支架梯度由CBD-SDF1α 低濃度區域向高濃度區域遷移, 部分遷移出來的單細胞遷移至材料中心區域.

圖2 有序梯度支架材料上NSCs 和NSCS 的遷移Fig.2 Migration of NSCs and NSCS on orderly gradient fiber scaffolds

圖3 為NSCS 在有序梯度支架上的遷移圖. 圖中(b)～(e)為NSCS 種植在放射狀有序支架外周后遷移1 d 的局部放大圖, 其中(b)為支架材料中心的部位即支架材料CBD-SDF1α 最高濃度區域, 可觀察到有少量NSCs 遷移到此處. NSCS 擴散出的NSCs 沿著CBD-SDF1α 濃度低的外周遷移至濃度高的中心(約5 mm).

圖3 NSCS 在有序梯度支架上的遷移Fig.3 Migration of NSCS on aligned gradient fiber scaffolds

圖4 顯示了NSCS 的擴散情況. 圖中(a)為種植在梯度有序支架材料外周的NSCS 在不同區域擴散出NSCs 數目的對比圖. 由于支架材料由中心至外周密度梯度逐漸降低, 故支架上負載的CBD-SDF1α 濃度也逐漸降低. 種植在距支架材料中心6 mm 位置處的NSCS 擴散出的NSCs 數目較種植在距支架材料中心8 mm 位置處擴散出的顯著增大(p<0.01). (b)為種植的NSCS 在支架材料不同位置擴散出NSCs 的面積與NSCS 面積比的對比圖. 種植在距離材料中心6 mm 位置處的NSCS 擴散出的NSCs 面積與NSCS 總面積之比, 與種植在距離材料中心8 mm 位置處的NSCS 擴散出的NSCs 面積與NSCS 總面積比相較顯著增大(p <0.05),說明CBD-SDF1α 濃度越高NSCS 擴散出的NSCs 越多, 并且擴散的距離更遠, 形成的擴散面積更大.

圖4 NSCS 的擴散情況Fig.4 Diffusion of NSCS on aligned gradient fiber scaffolds

圖5 為NSCS 在有序梯度支架材料上的定向遷移圖. 分別選取(a)和(b) 2 個不同方向進行拍攝, 可明顯觀察到NSCS 有沿纖維支架方向遷移的趨勢, 且有部分NSCs 從NSCS 中遷移出.

圖5 NSCS 在有序梯度支架材料上的定向遷移Fig.5 Directional migration of NSCS on aligned gradient fiber scaffolds

3.3 NSCS的遷移形態

圖6 為NSCS 遷移過程中的形態圖. 圖中, NSCS 遷移培養1 d 后熒光染色, DAPI (藍色)、Nestin(綠色)、CXCR4(紅色)標志NSCS 遷移過程中的形態變化. CXCR4 是基質衍生因子SDF1α 的特異性受體, 在NSCs 遷移過程中起重要的調控作用[12-14]. 圖6(c)顯示了NSCS在纖維方向上(橫向)呈明顯伸展形態, 表明NSCS 中的CXCR4 積極應答CBD-SDF1α, 使NSCS 沿著梯度有序纖維方向上呈現極化及定向延伸.

4 結束語

本工作通過簡單易行、條件可控的方法制備連續性密度梯度有序纖維支架, 負載CBDSDF1α 形成連續性濃度梯度有序支架. 這種納米至微米級的梯度材料同時提供有序拓撲結構與生物活性分子濃度梯度, 可誘導NSCs 以及NSCS 長距離定向遷移. 在此過程中還可以觀察到, NSCS 在遷移中會緩慢遷移出NSCs, 在CBD-SDF1α 濃度高的纖維支架區域遷移出的NSCs 在遷移數量與距離上明顯高于在CBD-SDF1α 濃度低的纖維支架區域. 本實驗材料應用于修復脊髓損傷時誘導NSCs 由脊髓斷端向中心缺損部位定向遷移的情況有待進一步探究.

圖6 NSCS 遷移過程中的形態Fig.6 Cell morphology of NSCS migrated on the aligned fiber scaffolds