miR-19b 通過激活Akt 信號通路保護心肌細胞凋亡

朱宏文, 喻溥蛟, 許嘉鴻

(1. 上海市安亭醫院心血管內科, 201805; 2. 同濟大學附屬同濟醫院心血管內科, 上海200065)

缺血性心臟病是常見的心血管疾病之一, 其致死率和致殘率較高, 嚴重危害人類健康. 目前已知的治療缺血性心臟病最有效的方法是及時有效地恢復心臟血流, 即再灌注治療[1]. 然而, 再灌注的治療過程會對已經發生缺血的心肌細胞造成進一步損害, 包括心肌細胞功能異常和細胞死亡, 這種心肌短時間內血流供應中斷, 在一定時間恢復血流后, 原本已經缺血的心肌會發生更為嚴重的損傷, 稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[2]. MIRI 的機制目前尚不清楚, 通常認為與炎癥、鈣超載、氧自由基的釋放等有關[3-6].目前, 依然缺乏有效的減輕MIRI 的方法[7], 因此尋找防治MIRI 的有效措施具有十分重要的意義.

微小RNA(microRNAs 或miRNAs)是高度保守的非編碼基因序列, 通常有21～23 個堿基參與轉錄后水平的調控, 多項研究表明miRNAs 在MIRI 發生發展過程中起到十分關鍵的調控作用[8-10]. miR-19b 是miR-17-92 基因簇的關鍵成員之一, 在腫瘤研究中miR-17-92 基因簇具有重要的抗凋亡作用[11]. 另外有研究報道, miR-19b 在心肌細胞中高表達并且為調控心肌增殖的重要分子[12], 這提示miR-19b 可能在心臟生理病理過程中發揮重要作用, 但是目前miR-19b 在心肌缺血再灌注損傷中的作用尚不清楚. 本工作探討miR-19b 在新生大鼠心肌細胞氧糖剝奪復氧(oxygen glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)模型中的作用及其相關分子機制.

1 實驗材料和方法

1.1 提取新生大鼠心肌細胞

用消化酶分解法提取新生大鼠心肌細胞, 75%酒精消毒后, 眼科剪摘取乳鼠心臟, 去除大血管及心房后在超凈臺中剪碎; 加入消化液在37?C 搖床上震蕩消化, 每隔30 min 換一次消化液, 直至組織塊完全消失; 每次收集上清以馬血清終止消化, 離心后去上清, 以重懸細胞團塊, 用孔徑為100 μm 的一次性篩網過濾掉膠原纖維等; 用“8”字法搖培養皿, 然后放入細胞培養箱差速貼壁30～60 min, 將差速貼壁后的細胞懸液(未貼壁細胞)吸取到50 mL 離心管中,1 000 r/min, 離心5 min, 棄上清; 用溫育的1×ADS(adenosine 5’-triphosphate disodium salt)重懸細胞, 運用Percoll 法獲得高純度的心肌細胞, 用原代心肌細胞培養基(DMEM(dulbecco’s modified eagle edium)+5%胎牛血清+10%馬血清+1%雙抗)重懸細胞, 并按實驗計劃所需的細胞密度布板, 細胞貼壁后進行轉染處理.

1.2 細胞轉染

細胞貼壁后進行轉染處理, 用無血清培養基稀釋miR-19b 模擬物(mimics)(終濃度50 nmol/L)、miR-19b 抑制物(inhibitor)(終濃度100 nmol/L)以及同源磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)-siRNA(終濃度75 nmol/L), Lipofectamine-2000助轉染, 轉染6～8 h 后換液(無血清培養基).

1.3 OGD/R 模型建立

在細胞轉染處理步驟結束20 h 時, 將細胞用無糖培養基(Gibco, 11966-025 公司)換液, 細胞板放入缺氧盒, 并在缺氧盒中同時放入缺氧袋(三菱電機(廣州)壓縮機有限公司), 培養箱孵育8 h 后, 換成原代心肌細胞培養基, 復氧復糖12 h.

1.4 α-actinin 與TUNEL 共染

在實驗終點從培養箱取出細胞培養板, 棄掉培養基, 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 4%的多聚甲醛固定細胞, 室溫, 20 min; PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 0.2% 的Trition X-100 破膜, 室溫, 20 min; PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS,10%山羊血清封閉, 室溫, 1 h; 吸盡封閉液,用10%山羊血清稀釋一抗, 孵一抗(α-actinin), 4?C, 過夜孵育; PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 10%山羊血清配制熒光二抗(cy3-anti-mouse),室溫,搖床孵育2 h(從此步驟開始全程避光);PBS 洗3 次,每次5 min;按照試劑盒(Vozyme, A111)說明書染TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2’-deoxyuridine 5’-triphosphate-biotin nick end labeling), 結束后PBS 洗3 次, 每次5 min; 吸干PBS, 用PBS 配制Hoechst, 染核, 室溫, 20 min; 到熒光顯微鏡下觀察和拍攝.

1.5 蛋白質免疫印跡法

在實驗終點將細胞板中的培養基吸盡, PBS 洗1 次, 吸盡PBS, 加入適量裂解液, 用細胞刮將貼壁細胞刮下來, 吸取至EP(eppendorf) 管, 冰上裂解細胞40 min 后, 4?C,14 000 g 離心20 min, 取上清液, 酶標儀測定蛋白樣品的濃度后, 定容定量, 保證每次上樣量一致. 加入5× 蛋白上樣緩沖液, 震蕩混勻, 100?C 水浴或者金屬浴熱變性5～10 min.配置十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacry lamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠, 等蛋白樣品冷卻到室溫后, 將其直接上樣到SDS-PAGE 加樣孔內. 100 V 恒壓電泳90 min, 結束后轉移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜,用含5%脫脂奶粉的TBST(tris-buffered saline and tween)緩沖液封閉2 h, 一抗孵育, 4?C孵育過夜. TBST 洗3 次, 每次10 min. 加入二抗, 搖床上室溫孵育2 h, TBST 洗3 次, 每次10 min. 最后迅速以ECL(enhanced chemiluminescent)發光液于膜上反應約1 min, 化學發光儀掃描并分析圖片.

1.6 統計學分析

用SPSS 24.0 統計軟件進行分析, 數據均采用“均值±標準差”表示, 組間比較采用單因素方差分析(one way analysis of variance), 兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗分析方法. P <0.05表示差異有統計學顯著性.

2 實驗結果

2.1 miR-19b 對OGD/R 誘導的心肌細胞凋亡有保護作用

圖1 TUNEL 法檢測OGD/R 模型中轉染miR-19b mimics 和miR-19b inhibitor 后的新生大鼠心肌細胞(neonatal rat cardiac myocytes, NRCM)凋亡水平Fig.1 Apoptosis of NRCM transfected by miR-19b mimics and miR-19b inhibitor in the OGD/R model as determined by TUNEL assay

圖2 新生大鼠心肌細胞OGD/R 模型中轉染miR-19b mimics 后凋亡蛋白表達水平Fig.2 Apoptosis protein expression of NRCM transfected by miR-19b mimics in the OGD/R model

圖3 新生大鼠心肌細胞OGD/R 模型中轉染miR-19b inhibitor 后凋亡蛋白表達水平Fig.3 Apoptosis protein expression of NRCM transfected by miR-19b inhibitor in the OGD/R model

本工作利用TUNEL 法和蛋白質免疫印跡法檢測心肌細胞氧糖剝離再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)誘導的新生大鼠心肌細胞凋亡水平(見圖1～3).TUNEL 染色結果顯示, 轉染miR-19b mimics 可緩解OGD/R 誘導的心肌細胞凋亡, 而miR-19b inhibitor 可進一步加重OGD/R 誘導的心肌細胞凋亡(見圖1). 圖1 中, Nc 表示空白對照,*表示P < 0.05, n=4. 同時, 蛋白質免疫印跡法結果表明, 在OGD/R 模型中, 轉染miR-19b mimics 可使Bax/Bcl2 比率和Cleaved caspase3/Caspase3 比率均降低(見圖2), 而轉染miR-19b inhibitor 能夠上調Bax/Bcl2 比率和Cleaved caspase3/Caspase3 比率(見圖3). 這里, 圖2 顯示了在OGD/R 模型中轉染miR-19b mimics 的蛋白質免疫印跡法結果, 其中*表示P <0.05, **表示P <0.01; n=3. 而圖3 顯示了在OGD/R 模型中轉染miR-19b inhibitor的蛋白質免疫印跡法結果, 其中*表示P <0.05, ***表示P <0.001; n=3.

2.2 miR-19b 可通過負向調控PTEN 激活Akt 信號通路

本工作利用蛋白質免疫印跡法檢測新生大鼠心肌細胞中PTEN、308 位點磷酸化Akt(pAkt308)和總Akt(tAkt)表達水平. 結果顯示, 轉染miR-19b mimics 后, PTEN 表達水平降低, pAkt308/tAkt 比率升高(見圖4), 而轉染miR-19b inhibitor 后, PTEN 表達水平升高,pAkt308/tAkt 比率降低(見圖5). 這里,圖4 顯示了轉染miR-19b mimics 后的PTEN、308位點磷酸化Akt(pAkt308)和總Akt(tAkt)蛋白表達水平結果, 其中*表示P < 0.05, n = 3. 圖5 顯示了轉染miR-19b inhibitor 后的PTEN、308 位點磷酸化Akt(pAkt308)和總Akt(tAkt)蛋白表達水平結果, 其中*表示P <0.05, **表示P <0.01; n=3.

圖4 NRCM 轉染miR-19b mimics 后的PTEN、308 位點磷酸化Akt(pAkt308)和總Akt(tAkt) 蛋白表達水平Fig.4 Expression of PTEN, Phospho-Akt(Thr308) and total Akt in NRCM transfected by miR-19b mimics

圖5 NRCM 轉染miR-19b inhibitor 后的PTEN、308 位點磷酸化Akt(pAkt308)和總Akt(tAkt) 蛋白表達水平Fig.5 Expression of PTEN,Phospho-Akt(Thr308)and total Akt in NRCM transfected by miR-19b inhibitor

2.3 PTEN 是miR-19b 對OGD/R 誘導的心肌細胞凋亡發揮保護作用的關鍵分子

利用TUNEL 法檢測OGD/R 誘導的新生大鼠心肌細胞凋亡水平. TUNEL 染色結果顯示, PTEN-siRNA 可以降低OGD/R 誘導的心肌細胞凋亡水平, 且PTEN-siRNA 可逆轉miR-19b inhibitor 對心肌細胞凋亡水平的促進作用(見圖6, 圖中**表示P < 0.01, n = 4). 本工作設計了2 條PTEN 的siRNA(PTEN-siRNA4 和PTEN-siRNA5).

圖6 TUNEL 法檢測NRCM 轉染miR-19b inhibitor 和/或PTEN-siRNA 后的凋亡水平Fig.6 Apoptosis of NRCM transfected by miR-19b inhibitor and/or PTEN-siRNA as determined by TUNEL assay

3 討 論

miR-17-92 是目前被研究得最多的miRNA 基因簇, 而miR-19b 是該基因簇的關鍵成員之一. 除了在乳腺癌和肝細胞癌等腫瘤發生發展過程中發揮促增殖和抗凋亡作用外[13-14],miR-19b 在心血管疾病的調控中也起重要作用, 包括動脈粥樣硬化、心臟纖維化、心肌肥厚等[15-17].

本工作構建了新生大鼠心肌細胞氧糖剝離再灌注(OGD/R)模型, 模擬心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的過程; 利用miR-19b mimics 和miR-19b inhibitor 來過表達和抑制miR-19b 的表達; 運用TUNEL 法和蛋白質免疫印跡法來檢測心肌細胞凋亡水平. 結果表明, miR-19b mimics 可降低OGD/R 模型誘導的心肌細胞凋亡, 而miR-19b inhibitor 作用則相反. 凋亡蛋白表達水平(Bax/Bcl2 比率和Cleaved caspase3/Caspase3 比率)檢測結果也與TUNEL 染色結果一致, 那么miR-19b對心肌細胞凋亡的保護作用是通過哪個下游靶點實現的呢？已有研究發現, PTEN 是miR-19b 的下游靶基因之一, PTEN 可通過將PI3K 去磷酸化, 來抑制Akt 信號通路, 而PI3K-Akt 通路是MIRI 的經典調控通路之一[18-20]. 本工作通過蛋白質免疫印跡法檢測PTEN 和Akt 磷酸化, 明確了miR-19b 可下調PTEN 的作用, 從而激活Akt 信號通路.另外, 功能逆轉實驗也證實了PTEN 的確是miR-19b 保護心肌細胞凋亡的關鍵下游分子, 因此本工作的結論是, miR-19b 可通過下調PTEN、激活Akt 信號通路, 從而保護OGD/R 模型誘導的心肌細胞凋亡.

另外, 本工作還存在很多不足之處: ①尚有待進一步進行動物整體水平的功能研究; ②分子間相互作用機制的研究較為淺顯. 在后續研究中, 將進一步完善動物實驗, 并將進一步深入探究分子間相互作用的機制.

總之, 本工作揭示了miR-19b 在OGD/R 模型誘導的心肌細胞凋亡中的保護作用及其分子機制, 為后續的體內實驗提供一定的研究基礎, 也為將來心肌缺血再灌注損傷的治療提供新的潛在干預靶點.