小鼠非酒精性脂肪性肝炎中線粒體功能的障礙

后文琳, 潘 雯, 付思藝, 宋美怡, 王 菲

(1. 上海大學生命科學學院, 上海200444; 2. 同濟大學附屬同濟醫院消化內科, 上海200065)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指脂肪在肝內積累超過肝臟總重的5%～10%, 同時出現彌漫性肝細胞大泡性脂肪變性. 病變主要是從單純性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver, NAFL)發展至非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 最后發展為非酒精性肝硬化(non-alcoholic cirrhosis, NAC)直至肝癌[1]. NAFLD 的進展是一個連續的過程, 最初NAFL 病變部位為肝小葉, 此時出現脂滴的肝細胞超過30%, 無其他組織學改變. NASH 是NAFL 的延續, 在肝細胞脂肪變性的基礎上發生以肝細胞氣球樣變、彌散性肝小葉炎癥為病理特征的慢性肝炎[2-3]. NASH 的相關肝硬化是長期炎癥導致的損害, 其病理結構可見肝細胞大量壞死、肝小葉結構破壞、纖維瘢痕形成以及肝組織變性等. NAFLD 的發病因素包括肥胖、糖代謝紊亂、高血壓、飲食結構的改變[4-5]等, 目前已成為我國最常見的肝臟疾病, 且發病率呈逐年上升的趨勢, 因此NAFLD 是近年來研究的主要熱點之一[6].

這幾年, NAFLD 被發現與線粒體功能障礙密切相關, 線粒體的功能在NAFLD 的發病和進展過程中起著重要作用[7-8]. 事實上, 早在1976 年Huttenlocher 等[9]就將肝臟疾病與線粒體疾病聯系在一起; 2012 年Gomez-Zorita等[10]研究發現, 白藜蘆醇可激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)的通路來降低氧化應激, 減少肝脂肪生成, 從而改善肝脂肪變性. 由于膽堿蛋氨酸缺乏(methionine choline deficient, MCD)飲食誘導的小鼠模型早期會出現肝細胞脂肪變性, 且后期會逐漸出現肝細胞炎性反應及纖維化反應, 故在國際上公認是成功復制NASH 模型之一[11]. 本工作旨在通過檢測小鼠NASH 模型中線粒體功能的變化, 探討線粒體對NASH 病變過程的影響, 從而研究其中可能的分子機制, 為預防及治療NASH 提供新的分子靶點.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性C57BL/6 小鼠,8～10 周齡,質量為(28±1)g,飼養于上海大學SPF(specific pathogen free)級動物房, 溫度(22±2)?C, 濕度50%～60%. 所有操作均遵守美國國立衛生院(National Institutes of Health, NIH)的相關規定.

1.1.2 實驗儀器

分光光度計, 微量移液器, 旋渦混勻器, 全自動生化分析儀, 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)儀, 實時熒光定量PCR(quantification real-time PCR, qRT-PCR)儀,Nano Drop 測定儀.

1.1.3 材料

采用膽堿蛋氨酸充足(methionine choline sufficient, MCS)作為對照組飼料[12], 選用膽堿蛋氨酸缺乏(methionine choline deficient, MCD)組飼料作為實驗組飼料[11]. 在MCS 飲食配方上減去膽堿2 g/kg、蛋氨酸3 g/kg(飼料均由江蘇南通特洛菲飼料有限公司提供); HE(hematoxylin-eosin)染色相關試劑購于美國Sigma 公司; 丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)、總膽固醇(total cholesterol, TC)測定和甘油三酯(triglyceride, TG)測定試劑盒均購于南京建成生物公司; PCR 相關試劑Trizol、反轉錄試劑盒和SYBR Green 購于Takara 公司; 384 孔PCR 板購于Roche 公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗方案

采用MCD 飲食構建小鼠NASH 模型,其對照組喂食MCS 的飼料. 8～10 周的C57BL/6 小鼠隨機分為2 組: MCS 對照組(n = 6)和MCD 實驗組(n = 6), 分別不間斷喂食4 周. 對照組以MCS 飼料喂養, NASH 模型組以MCD 飼料喂養. 4 周后, 禁食不禁水, 次日稱體重后, 腹腔注射麻醉, 固定打開腹腔, 采取下腔靜脈采血, 迅速游離并取出肝臟, 預冷生理鹽水沖盡血跡后, 稱量肝臟濕質量, 計算肝指數(肝指數=肝質量/體質量×100%). 取部分肝組織用4%多聚甲醛固定, 其余?80?C 冰箱保存.

1.2.2 血清生化指標檢測

利用試劑盒檢測小鼠血清中ALT(南京建成生物公司, C009-3)、AST(南京建成生物公司,C010-1)、TC(南京建成生物公司, A111-2)和TG(南京建成生物公司, A110-2)的相關水平.

1.2.3 HE 染色

二甲苯梯度酒精脫蠟; 1×PBS 洗3 遍, 每次5 min; 蒸餾水輕洗1～2 min, 用力甩掉水分;核染液染色5 min, 水洗3～5 s; 漿液染色20 s; 增色液沖洗1 次, 自然晾干; 封片后于Leica 生物顯微鏡下觀察.

1.2.4 DNA 的提取

通過DNeasy Blood & Tissue 試劑盒(德國Hilden Qiagen 公司)提取總DNA, 包括線粒體DNA(mtDNA)和核內基因組DNA(nDNA).

1.2.5 RNA 的提取

運用Trizol 試劑(日本Takara 公司)抽提總RNA, 使用Nano Drop 儀測定RNA 的濃度和純度.

1.2.6 熒光定量PCR

通過Trizol-異丙醇法提取小鼠肝臟組織的RNA, 將RNA 逆轉錄為cDNA 后檢測基因mRNA 水平的表達, 取1μg 的總RNA, 加入5×逆轉錄試劑2μL, 利用DEPC(diethyl pyrocarbonate)水將總體積補充到10 μL, 并利用合成的cDNA 和特異性的PCR 引物檢測目標mRNA 的表達,擴增的DNA 產物以SYBR Green 標記,采用18S 作為內參基因,以2???CT的計算方法進行相對表達量計算. 本工作采用的引物序列如表1 所示.

表1 qRT-PCR 引物序列Table1 Sequences of the primers for qRT-PCR

1.2.7 統計方法

運用SPSS 20.0 統計軟件進行分析, 實驗數據均采用“均值±標準差”方法表示, 分析前進行方差齊性檢驗. 當滿足條件時,選用獨立樣本t 檢驗進行2 組間比較,P <0.05 表示有統計學差異.

2 結 果

2.1 MCD 飲食誘導的NASH 模型的建立

經過MCD 飼料喂養的的小鼠體重、肝重、肝重/體重、腹股溝脂肪、腹股溝脂肪/體重、附睪脂肪、附睪脂肪/體重、肩胛骨脂肪較MCS 組顯著下降, 肝重/體重(肝指數)、肩胛骨脂肪/體重無明顯差異(見表2)，這說明MCD 喂食成功誘導了NASH 的發生.

表2 經過4 周MCD 飲食后小鼠的特征Table2 Characteristics of mice after four weeks of experimental diets

2.2 MCD 小鼠生化指標和肝組織病理學形態的變化

與對照組相比, MCD 組小鼠血清中ALT 和AST 活性、肝臟組織中TG 水平較MCS 組顯著提高(見圖1(a)～1(c)), 而TC 水平降低(見圖1(d)). 此外, HE 染色情況下在光學顯微鏡下可見對照組小鼠肝小葉結構清晰, 未見脂肪變性及炎癥細胞浸潤; 而MCD 組在光學顯微鏡下可見肝組織變性嚴重, 有大量脂肪空泡, 小葉結構破壞嚴重, 炎細胞浸潤明顯(見圖1(e)), 進一步證實了模型構建成功.

2.3 MCD 小鼠中線粒體功能的變化

成功構建小鼠NASH 模型后, 本工作采用qRT-PCR 分別檢測了小鼠肝臟組織中mtDNA(mitochondrial DNA, mtDNA)和nDNA(nuclear DNA, nDNA), 結果顯示MCD 組mtDNA/nDNA 表達量明顯降低(見圖2(a)), 說明MCD 組小鼠肝臟線粒體的mtDNA/nDNA 的值降低. 同時檢測線粒體DNA 復制相關的基因(POLG, SSBP1, TWINKLE 和TOP1MT)的表達變化發現, TOP1MT 的表達量明顯降低, POLG, SSBP1 和TWINKLE 表達無明顯差異(見圖2(b)), 這說明線粒體的生成能力受到影響. 然后檢測線粒體DNA 編碼的參與能量代謝的基因(ND1, ND2, ND6, COX1, COX2, 16S rRNA, ATPase6 和CYTB)的表達變化. 結果發現, 與對照組相比, MCD 組中在線粒體DNA 編碼的參與能量代謝的基因中, MCD 組中ND1,ND6, COX1, COX2, 16S rRNA 和CYTB 的表達量明顯降低(見圖3), 說明MCD 飼養的小鼠肝組織線粒體的mtDNA/nDNA 值降低, 功能受到損傷.

圖1 MCD 飲食對肝臟中血脂和轉氨酶水平和肝臟病理形態的影響(**: P<0.01, ***: P<0.001;n=6)Fig.1 Effects of the MCD diet on serum lipids,transaminase levels and hepatic pathological changes in liver (**: P<0.01, ***: P<0.001; n=6)

圖2 線粒體DNA 和線粒體DNA 復制的基因的表達水平(*: P<0.05, ***: P<0.001; n=6)Fig.2 Expressions of mtDNA replication-related genes and mitochondrial DNA(*: P<0.05,***: P<0.001; n=6)

2.4 MCD 小鼠肝臟中能量代謝相關的PGC-1 信號通路中相關基因的變化

采用qRT-PCR 檢測NASH 小鼠肝臟中能量代謝相關的PGC-1 通路相關的基因(PGC-1α, PGC-1β, NRF1, NRF2A, NRF2B2, TFAM, TFB1M 和TFB2M). 結果發現, 與對照組相比, MCD 組中PGC-1β, NRF1, NRF2A, NRF2B2, TFAM, TFB1M 和TFB2M 表達水平均明顯降低, 但PGC-1α 表達水平無明顯差異(見圖4). 事實上, 與PGC-1α 相比, 在高呼吸活性的細胞中PGC-1β 呈現高表達[13], 這說明MCD 組的能量代謝能力減弱.

圖3 線粒體DNA 編碼參與能量代謝相關基因的表達水平(*: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001;n=6)Fig.3 Expression levels of genes involved in energy metabolism encoded by mitochondrial DNA (*: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001; n=6)

圖4 在肝臟中調控PGC-1 通路相關基因的表達水平(*: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001; n=6)Fig.4 Regulation of PGC-1 pathway related gene expression in the liver (*: P<0.05, **:P<0.01, ***: P<0.001; n=6)

3 討 論

NAFLD 是臨床常見的疾病之一, 是一種由多種疾病或者因素引起的以肝臟脂肪積蓄過多為特征的慢性疾病, 其15%～25%的病歷可發展為肝硬化[14-15]. NASH 作為NAFLD 病程中最關鍵的環節, 是單純性脂肪肝發展為肝纖維化和肝硬化的必經階段[16], 因此對NASH 的發病機制的研究和防治就顯得格外重要[17].

越來越多的研究證明, 線粒體功能障礙會誘導肝臟炎性反應、肝細胞壞死和肝纖維化的發生[18], 進而導致NASH 的發生和發展. 眾所周知, 線粒體是真核細胞能量代謝過程中重要的細胞器之一, 是ATP 產生的主要場所, 在細胞內分裂和融合的動態結構中起平衡作用[19]. 據報道, 當線粒體受損時膜電位下降從而導致ATP 合成減少, 肝細胞質膜發生脂質過氧化損傷, 進而導致NASH 的發生[20].

在本工作中可以發現, 在MCD 飼料喂養的小鼠組中, 線粒體的mtDNA/nDNA 和編碼的基因(ND1,ND2,ND6,COX1,COX2,16S,ATPase6 和CYTB)線粒體復制相關基因(POLG,SSBP1, TWINKLE 和TOP1MT)表達水平出現降低的情況, 這表明線粒體數量和功能的降低可能對NASH 的發病起到了促進作用; 同時, 從PGC-1 介導的能量代謝來看, PGC-1 通路中PGC-1β, NRF1, NRF2A, NRF2B2, TFAM, TFB1M 和TFB2M 表達水平降低, 表明能量代謝能力降低.

在MCD 飲食誘導的NASH 模型中, 小鼠肝臟中線粒體的生成、維持線粒體的功能和激活PGC-1 途徑均受到阻礙, 可見線粒體的數量及功能障礙與NASH 發病密切相關, 并會導致NASH 進程加快. 根據此研究, 通過促進線粒體的生成可能是治療NAFLD 的一種方法, 為臨床治療提供新的思路.