心肌細(xì)胞直接重編程研究進(jìn)展

心血管疾病的典型特征是心肌細(xì)胞丟失、膠原沉積以及瘢痕形成[1]。Ieda等[2]首次提出轉(zhuǎn)錄因子Gata4、Mef2c和TBx5(GMT)可以將小鼠的心臟成纖維細(xì)胞在體外直接重編程為心肌樣細(xì)胞，隨后有很多研究利用轉(zhuǎn)錄因子、微小RNA(miRNA)及小分子來(lái)提高心肌細(xì)胞直接重編程的效率。但是，這些方法都是通過(guò)將逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒整合到基因組中來(lái)實(shí)現(xiàn)成纖維細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化，這有可能會(huì)引起基因突變和表達(dá)中斷等風(fēng)險(xiǎn)，使重編程效率降低。因此，有學(xué)者提出用非整合型病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)行心肌細(xì)胞直接重編程，以彌補(bǔ)之前研究的不足。

1 整合型病毒載體直接重編程

1.1 體外直接重編程

Ieda等[2]利用GMT進(jìn)行的重編程雖然效率低下，但是為后來(lái)的心肌細(xì)胞直接重編程研究奠定了基礎(chǔ)。Song等[3]發(fā)現(xiàn)在GMT的基礎(chǔ)上加入轉(zhuǎn)錄因子Hand2(GHMT)也可以將小鼠的心臟成纖維細(xì)胞和鼠尾成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞。在成年小鼠的鼠尾成纖維細(xì)胞中，GHMT可誘導(dǎo)9.2% (5.2%～19.7%)的心肌樣細(xì)胞同時(shí)表達(dá)心肌重鏈蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白(αMHC-GFP)和心臟肌鈣蛋白 T (cTnT)，而GMT僅能誘導(dǎo)2.9%(1.5%～5.6%)的心肌樣細(xì)胞同時(shí)表達(dá)aMHC-GFP和cTnT。在成年小鼠的心臟成纖維細(xì)胞中，用GHMT轉(zhuǎn)染可以使7.5%的心肌樣細(xì)胞同時(shí)表達(dá)aMHC-GFP和cTnT，而用GMT轉(zhuǎn)染僅有1.4%的心肌樣細(xì)胞表達(dá)aMHC-GFP和cTnT。轉(zhuǎn)染1個(gè)月后，GHMT就可誘導(dǎo)成年小鼠的心臟成纖維細(xì)胞和鼠尾成纖維細(xì)胞直接重編程為有自發(fā)性跳動(dòng)的心肌樣細(xì)胞，而且這些細(xì)胞具有鈣離子瞬變和電活動(dòng)特性，這提示加入Hand2可以提高心肌細(xì)胞直接重編程的效率。此后，有研究將更多的轉(zhuǎn)錄因子加入GMT以提高心肌細(xì)胞直接重編程的效率。Addis等[4]發(fā)現(xiàn)在GHMT的基礎(chǔ)上加入轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5(HNGMT)可以高效地將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和成年小鼠的心臟成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，HNGMT的效率比單用GMT高出50倍，而且誘導(dǎo)的心肌樣細(xì)胞可以表達(dá)更多的心臟標(biāo)記物，具有鈣瞬變特性，可以長(zhǎng)時(shí)間維持自發(fā)性跳動(dòng)。

Protze等[5]發(fā)現(xiàn)使用慢病毒轉(zhuǎn)染Tbx5、Mef2c和Myocd(3F-Myocd)可以將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞。與GMT相比，3F-Myocd誘導(dǎo)的心肌樣細(xì)胞可以表達(dá)更多的心臟標(biāo)記物，這提示Gata4可能并不是心肌細(xì)胞直接重編程所必須的核心轉(zhuǎn)錄因子。Mathison等[6]也證實(shí)了單獨(dú)使用Gata4確實(shí)不能誘導(dǎo)產(chǎn)生心肌樣細(xì)胞，但是單獨(dú)用慢病毒轉(zhuǎn)染Gata4可以顯著減小心肌梗死后纖維化面積，從而改善心功能。

Zhou 等[7]發(fā)現(xiàn)Bmi1是心肌細(xì)胞直接重編程早期主要的表觀遺傳障礙，通過(guò)短發(fā)夾RNA(shRNA)抑制Bmi1可以提高組蛋白第三亞基4號(hào)賴氨酸的三甲基化(H3K4me3)水平，同時(shí)抑制心臟位點(diǎn)上的組蛋白H2A在賴氨酸119(H2AK119ub)的單鏈化，從而顯著提高GMT的直接重編程效率。該研究還發(fā)現(xiàn)抑制Bmi1可以使內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子Gata4增多，從而減少了直接重編程過(guò)程中外源性Gata4的加入。這證明去除某些表觀遺傳障礙后，使用較少的轉(zhuǎn)錄因子就可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的直接重編程。通過(guò)shRNA調(diào)控表觀遺傳來(lái)提高重編程效率是心肌細(xì)胞直接重編程的重要進(jìn)展，提示其他分子也可能通過(guò)調(diào)控表觀遺傳機(jī)制促進(jìn)心肌細(xì)胞直接重編程。

Abad等[8]證實(shí)在GHMT的基礎(chǔ)上加入經(jīng)典的Notch抑制劑DAPT可以促進(jìn)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。與GHMT相比，DAPT的加入使有肌節(jié)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞數(shù)量增加了5倍，在第25天時(shí)自發(fā)跳動(dòng)的心肌樣細(xì)胞數(shù)量增加了6倍，具有鈣瞬變特性的細(xì)胞數(shù)量也顯著增加。在此基礎(chǔ)上加入絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(Akt1)可以使高達(dá)70%的心肌樣細(xì)胞表達(dá)cTnT。更重要的是，在第18天時(shí)45%的心肌樣細(xì)胞即可發(fā)生自發(fā)性跳動(dòng)。該研究還發(fā)現(xiàn)，DAPT可通過(guò)激活與轉(zhuǎn)錄因子Mef2c連接的心臟相關(guān)基因(Myh6、Tnnt2、Actc2)，提高心肌細(xì)胞直接重編程的效率。

Guo等[9]通過(guò)化學(xué)篩選的方法發(fā)現(xiàn)IMAP(胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、MII1抑制劑MM589、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β抑制劑A83-01和Bmi1抑制劑PTC-209)的協(xié)調(diào)作用可以提高心肌細(xì)胞直接重編程效率，它們通過(guò)抑制特定的C-C趨化因子信號(hào)通路[C-C基序趨化因子配體(CCL)3、CCL6、CCL17]和增加轉(zhuǎn)錄因子Gata4、Mef2c、TBx5的表達(dá)，提高心肌細(xì)胞直接重編程效率。

1.2 體內(nèi)直接重編程

Qian等[10]首次證實(shí)了用逆轉(zhuǎn)錄病毒GMT可以誘導(dǎo)小鼠的心臟成纖維細(xì)胞在體內(nèi)直接重編程為心肌樣細(xì)胞。在體內(nèi)，心肌樣細(xì)胞形成了肌節(jié)結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生動(dòng)作電位，還可以對(duì)電刺激產(chǎn)生收縮反應(yīng)。GMT轉(zhuǎn)染后的第8周和第12周，超聲心動(dòng)圖檢查發(fā)現(xiàn)心臟的射血分?jǐn)?shù)、心搏出量和心輸出量均增加，而心肌梗死的面積減小。Song等[3]進(jìn)一步證實(shí)了用逆轉(zhuǎn)錄病毒GHMT可以將小鼠心臟成纖維細(xì)胞在體內(nèi)直接重編程為心肌樣細(xì)胞。超聲心動(dòng)圖檢查發(fā)現(xiàn)GHMT轉(zhuǎn)染后的第6周小鼠的心功能就開(kāi)始改善，GHMT比GMT能更有效地改善心功能。Zhang等[11]后來(lái)也證實(shí)，加入轉(zhuǎn)錄因子Hand2可顯著改善心肌樣細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)心臟的4種轉(zhuǎn)錄因子GHMT在心肌樣細(xì)胞的肌節(jié)結(jié)構(gòu)和收縮特性的形成過(guò)程中至關(guān)重要，這4種轉(zhuǎn)錄因子中沒(méi)有一種轉(zhuǎn)錄因子可以獨(dú)立地將成纖維細(xì)胞直接重新編程成為心肌樣細(xì)胞。

Mathison等[12]發(fā)現(xiàn)用慢病毒多順?lè)醋覩MT轉(zhuǎn)染可以促進(jìn)小鼠體內(nèi)外心肌細(xì)胞直接重編程。蛋白質(zhì)印跡分析顯示三聯(lián)體(多順?lè)醋覩MT)和單體(單順?lè)醋覩ata4、Mef2c、Tbx5)載體產(chǎn)生了等同的GMT轉(zhuǎn)基因表達(dá)，而熒光激活細(xì)胞分選(FACS)顯示三聯(lián)體載體直接重編程的能力大約是是單體載體的2倍。此外，與3個(gè)單獨(dú)的單順?lè)醋虞d體(EF=7%～13%)相比，單個(gè)多順?lè)醋覩MT載體(EF=10%～37%)可以顯著改善小鼠的心功能。多順?lè)醋虞d體可以通過(guò)單個(gè)病毒載體誘導(dǎo)心肌樣細(xì)胞形成來(lái)提高心肌細(xì)胞直接重編程效率，而不需要每個(gè)單順?lè)醋虞d體的3次分別轉(zhuǎn)染，這就減少了轉(zhuǎn)染的次數(shù)，從而降低了多次轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的免疫原性、不良反應(yīng)及對(duì)轉(zhuǎn)分化過(guò)程的抵抗性。Inagawa等[13]也證實(shí)了利用逆轉(zhuǎn)錄病毒多順?lè)醋覩MT載體可以將梗死心肌的成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞。

1.3 miRNA參與的直接重編程

Jayawardena等[14]發(fā)現(xiàn) miRNA的特定組合能夠在體內(nèi)外將非心肌細(xì)胞直接重新編程成為心肌樣細(xì)胞。他們證實(shí)了單用miR-1就可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞，但與miR-133、-208、-499聯(lián)合作用可使直接重編程的效率顯著提高。miR-1、-133、-208、-499不僅可以使心肌樣細(xì)胞表達(dá)心臟標(biāo)記物，而且還使其具有自發(fā)鈣瞬變及收縮特性。隨后Jayawardena等[15]使用同樣的miRNA來(lái)評(píng)估體內(nèi)心肌樣細(xì)胞的形態(tài)和生理特性以及對(duì)左室收縮功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA不僅產(chǎn)生了與成熟心肌細(xì)胞相似的肌節(jié)結(jié)構(gòu)，而且還可以誘發(fā)動(dòng)作電位及興奮-收縮耦聯(lián)反應(yīng)。經(jīng)反復(fù)超聲心動(dòng)圖檢查發(fā)現(xiàn)，miRNA可在心肌梗死后1個(gè)月內(nèi)減小纖維化面積，并在3個(gè)月內(nèi)逐步改善心室的收縮功能，這提示心功能在逐步改善。該研究認(rèn)為成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)、分化、整合、成熟所需的時(shí)間可能是左室收縮功能延遲和逐步改善的原因。

2 非整合型病毒載體直接重編程

2.1 仙臺(tái)病毒(SeV)載體直接重編程

SeV載體為單負(fù)鏈RNA病毒，具有高效轉(zhuǎn)導(dǎo)、非整合性、低污染等優(yōu)點(diǎn)，主要用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)的研究[16-18]。Miyamoto等[19]證實(shí)在體外用SeV-GMT誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞1周后就可以出現(xiàn)aMHC-GFP+、α輔肌動(dòng)蛋白(α-Actinin+)、cTnT+的細(xì)胞，這些免疫陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量可持續(xù)增長(zhǎng)直至第4周，且在第4周心肌樣細(xì)胞就可以表現(xiàn)出良好的肌節(jié)結(jié)構(gòu)。在胚胎成纖維細(xì)胞中，用SeV-GMT誘導(dǎo)產(chǎn)生的心肌樣細(xì)胞比用逆轉(zhuǎn)錄病毒GMT誘導(dǎo)產(chǎn)生的多100倍，并且心肌樣細(xì)胞的跳動(dòng)時(shí)間可以從第25天提前到第10天。與內(nèi)源性心肌細(xì)胞相似，SeV-GMT誘導(dǎo)的心肌樣細(xì)胞對(duì)腎上腺素能和膽堿能刺激均有反應(yīng)。在體內(nèi)，SeV-GMT同樣可以增加心臟直接重編程的效率，改善心功能，同時(shí)減小心肌梗死后的瘢痕面積。SeV-GMT轉(zhuǎn)染后，1.5%的心臟成纖維細(xì)胞在1周后被重編程為心肌樣細(xì)胞，其中約20%具有良好的肌節(jié)結(jié)構(gòu)。4周后重編程效率提高至5%，其中約40%的心肌樣細(xì)胞在形態(tài)上趨于成熟。SeV-GMT載體也可以將人成纖維細(xì)胞直接重新編程為心肌樣細(xì)胞，但是該心肌樣細(xì)胞沒(méi)有自發(fā)性跳動(dòng)，只有與新生小鼠的心肌細(xì)胞共培養(yǎng)1～2周后才可以使心肌樣細(xì)胞與周圍的心肌細(xì)胞同步收縮。

2.2 金納米顆粒(AuNP)/GMT/PEI載體直接重編程

Passaro等[20]提出納米技術(shù)具有獨(dú)特的靶向定位能力，能維持所負(fù)載物質(zhì)穩(wěn)定的生物活性，可推廣應(yīng)用于心肌細(xì)胞重編程。Chang等[21]證實(shí)負(fù)載有Gata4、Mef2c和Tbx5的陽(yáng)離子AuNP確實(shí)可用于心肌細(xì)胞直接重編程。在體外，與GMT/PEI載體相比，使用AuNP/GMT/PEI載體轉(zhuǎn)染2周后aMHC-GFP+的細(xì)胞增加了近3倍，且心肌樣細(xì)胞產(chǎn)生了具有明顯Z線結(jié)構(gòu)的肌節(jié)形態(tài)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，用AuNP/GMT/PEI載體轉(zhuǎn)染后，心肌細(xì)胞標(biāo)記物(Tbx18、Myl2、cTnT和Myh6)顯著增加，而成纖維細(xì)胞標(biāo)記物(結(jié)蛋白、Fsp1和Col1a1)被顯著抑制。在轉(zhuǎn)染5周后，AuNP/GMT/PEI載體誘導(dǎo)產(chǎn)生的能自發(fā)跳動(dòng)的心肌樣細(xì)胞是GMT/PEI載體的5倍多。在體內(nèi)，AuNP/GMT/PEI納米載體轉(zhuǎn)染使小鼠的心肌梗死面積明顯減小。AuNP/GMT/PEI納米載體也可以將人皮膚成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞。在用AuNP/GMT/PEI納米載體轉(zhuǎn)染2周后可以觀察到與內(nèi)源性心肌細(xì)胞形態(tài)相似的心肌樣細(xì)胞。

3 直接重編程的可能機(jī)制

3.1 抑制成纖維細(xì)胞信號(hào)增強(qiáng)心肌細(xì)胞直接重編程

Zhao等[22]證實(shí)了抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β或Rho相關(guān)激酶(ROCK)參與的促纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞，且效率高達(dá)60%，在抑制促纖維信號(hào)后不到2周的時(shí)間內(nèi)即可出現(xiàn)自發(fā)跳動(dòng)的心肌樣細(xì)胞，而單用GHMT則需要4周。Mohamed等[23]進(jìn)一步證實(shí)了體外聯(lián)合使用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β抑制劑(SB431542)和WNT抑制劑(XAV939)可使GMT的直接重編程效率提高8倍。在體內(nèi)，與GMT相比， GMT聯(lián)合SB431542和XAV939轉(zhuǎn)染可顯著提高心肌梗死后小鼠心肌細(xì)胞直接重編程的效率，改善其心功能。超聲心動(dòng)圖檢查發(fā)現(xiàn)心臟的每搏輸出量、射血分?jǐn)?shù)、心輸出量明顯改善，瘢痕面積明顯減小。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SB431542可下調(diào)纖維化信號(hào)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的形成[24]，而XAV939下調(diào)了與染色質(zhì)調(diào)控、DNA包裝和核小體結(jié)構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)[25]。

3.2 抑制炎性反應(yīng)增強(qiáng)心肌細(xì)胞直接重編程

Muraoka等[26]發(fā)現(xiàn)將雙氯芬酸鈉加入GMT或者GHMT，可顯著提高出生后小鼠心臟成纖維細(xì)胞和鼠尾成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞的效率,但是并不能提高小鼠胚胎成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌樣細(xì)胞的效率。該研究證實(shí)雙氯芬酸通過(guò)抑制環(huán)氧合酶-2、前列腺素E2/前列腺素E受體4、環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶a和白細(xì)胞介素-1β信號(hào)，阻止炎性反應(yīng)和心肌纖維化的進(jìn)一步發(fā)展，從而提高心肌細(xì)胞直接重編程效率。Zhou等[27]也證實(shí)了鋅指轉(zhuǎn)錄因子281(ZNF281)可通過(guò)調(diào)節(jié)心臟和炎性基因的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞直接重編程效率。這提示抑制成纖維細(xì)胞信號(hào)是心肌細(xì)胞直接重編程的先決條件，抗炎可能是促進(jìn)心肌細(xì)胞直接重編程的途徑，二者協(xié)同作用可能會(huì)大大提高心肌細(xì)胞直接重編程的效率。

4 展望

心肌細(xì)胞再生是富有挑戰(zhàn)性的新研究領(lǐng)域。細(xì)胞直接重編程技術(shù)是指將一種終末分化的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N終末分化的細(xì)胞，而不經(jīng)過(guò)iPSC階段和去分化、再分化等過(guò)程。使用整合型逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)產(chǎn)生心肌樣細(xì)胞可能會(huì)破壞內(nèi)源基因的表達(dá)，帶來(lái)插入突變等風(fēng)險(xiǎn)。最重要的是，使用整合型病毒載體直接重編程的過(guò)程緩慢且效率低下，這會(huì)阻礙心肌細(xì)胞直接重編程技術(shù)的發(fā)展。因此，學(xué)者們探索了適用于體內(nèi)外心肌細(xì)胞直接重編程且效率較高的非整合型病毒載體直接重編程的方法。非整合型病毒載體具有細(xì)胞毒性小、轉(zhuǎn)導(dǎo)高效、污染率低等優(yōu)點(diǎn)，在未來(lái)的生物醫(yī)學(xué)再生領(lǐng)域?qū)?huì)有著廣闊的應(yīng)用前景。然而，要將這項(xiàng)技術(shù)運(yùn)用到臨床還需要對(duì)心肌細(xì)胞直接重編程的確切分子機(jī)制及其適宜的微環(huán)境進(jìn)行深入研究。