負壓封閉引流干預創傷后應激代謝的實驗研究

陳駕君，楊 帆，解 杰，王 翔，胡 耑，白祥軍

擠壓傷后缺血組織可發生再灌注損傷和代謝性酸中毒[1]。當恢復再灌注時，如果糾酸過快會導致酸堿(pondus hydrogenii，pH)反常[2]；過慢則會損傷線粒體，加重代謝障礙和酸中毒[3]，從而誘發“致死性三聯征”[4]。因此，如何調控代謝平衡，成為缺血后預處理(ischemic postconditioning)研究的方向之一[5]。

負壓封閉引流(vacuum sealing drainage，VSD)技術臨床上可顯著改善擠壓傷預后[6]。實驗證實，其可通過減輕炎癥反應和調節活性氧含量，改善缺血再灌注損傷[7]，并與糖酵解酶密切相關[8]。因此，筆者擬通過動物實驗觀察VSD技術對再灌注后己糖激酶2(hexosekinase，HK2)、磷酸果糖激酶1(Phosphofructokinase1，PFK1)，丙酮酸激酶M1(pyruvate kinase M1，PKM1)、乳酸鹽脫氫酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)、丙酮酸脫氫酶激酶4(pyruvate dehydrogenase kinase4，PDK4)，丙酮酸(pyruvic acid，PA)和乳酸(lactic acid，LA)，以及pH值和陰離子間隙(anion gap，AG)值的影響，以探討其保護作用的可能機制。

材料與方法

1實驗動物建模和分組

雄性新西蘭白兔30只，飼養和科學操作均符合《實驗動物管理條例》。稱重后按照150 mg/kg的劑量，耳緣靜脈注射鹽酸氯胺酮注射液麻醉，按文獻報道[7]制備缺血再灌注損傷模型。將動物隨機分為3組，即假手術組、缺血再灌注組(I/R組)和VSD干預的缺血再灌注組(I/R+VSD組)，每組10只。(1)假手術組動物僅完成左后肢股動靜脈組織游離，為假手術對照；(2)I/R組動物完成組織游離后進行左后肢股動靜脈的夾閉(6h)及開放(6h)，不進行VSD干預；(3)I/R+VSD組動物在進行再灌注的同時對損傷處予以VSD(-70kPa，6h)干預。

2主要儀器、材料和試劑

(1)儀器：Shimadzu LC-10AVP高效液相色譜檢測儀(日本島津株式會社)、GEM Premier 3000全自動血氣分析儀(美國Instrumentation Laboratory公司)；(2)材料：VSD一次性使用負壓引流護創材料(武漢維斯第公司)；(3)試劑：HK2檢測試劑盒(美國Blue gene公司)、PFK1檢測試劑盒(美國Aviva systems biology公司)和PKM1檢測試劑盒(美國Elabscience 公司)；(4)免疫印跡法：LDHA抗體和PDK4抗體(美國Aviva systems biology公司)。

3樣本取材和檢測

(1)糖酵解限速酶：實驗結束后將兔處死，使用冰去離子水對獲取的骨骼肌組織進行沖洗勻漿，低溫離心機以3 000r/min離心10min，取上清以酶聯免疫吸附法進行檢測。

(2)糖酵解相關酶：引入β-actin作為內參，采用免疫印跡法檢測。分別于建模時(0)、再灌注前(4h)和實驗結束后(10h)3個時間點在損傷肌肉同一區域取材，取漂洗干凈的骨骼肌組織，提取總蛋白進行15% SDS-PAGE，并轉移至硝酸纖維素膜上，封閉過夜后，依次加入抗體，使用化學發光法進行顯色。

(3)糖酵解代謝產物：處死后使用冰去離子水對獲取的組織進行沖洗，取100mg加入0.9%NaCl(含0.5mmol/L EDTA-2Na)和3%HClO4溶液制成10%勻漿液，依次沉淀蛋白、離心、取上清，應用高效液相色譜法進行檢測，色譜條件為：5μm，C18柱(3.9mm×150mm)，流動相為95%磷酸鹽緩沖液(PBS)和5%甲醇(MeOH)，調pH至2.5，等比洗脫，流速為0.8mL/min，檢測波長220nm，柱溫20℃，進樣量10μL。

(4)血氣：分別于建模時、再灌注前、處死前3個時間點，于兔左后肢股動脈處抽取動脈血3mL，應用全自動血氣分析儀進行檢測。

4統計學分析

結果

1骨骼肌組織中糖酵解限速酶的變化

與假手術組比較，I/R組和I/R+VSD組在實驗結束后測的HK2、PKF1和PKM1均顯著性升高(P<0.05)；與I/R組比較，I/R+VSD組在實驗結束后測的各值均顯著性升高(t=2.609，P=0.030；t=2.258，P=0.040和t=1.850，P=0.047)。見表1。

與假手術組相比：*P<0.05，**P<0.01；與缺血再灌注組相比：ΔP<0.05

2骨骼肌組織中糖酵解相關酶表達的變化

與假手術組比較，I/R組和I/R+VSD組在建模時(0h)、再灌注前(4h)和實驗結束后(10h)LDHA表達相對灰度比分別為1.011±0.007和0.985±0.016、25.492±4.441和24.388±4.663、20.613±4.753和28.177±5.283；而PDK4表達相對灰度比分別為0.997±0.004和1.013±0.009、17.440±3.263和16.998±3.528、15.438±4.125和22.492±6.552；其中，I/R組和I/R+VSD組在再灌注前和實驗結束后LDHA和PDK4表達顯著性升高(F=2.996，P=0.049和F=18.561，P<0.001，F=4.265，P=0.024和F=26.856，P<0.001)；與I/R組比較，I/R+VSD組實驗結束后LDHA和PDK4表達顯著性升高(t=2.768，P=0.031和t=3.005，P=0.025)。見圖1。

3骨骼肌組織中糖酵解代謝產物和比值的變化

與假手術組的PA、LA和LA/PA比值[(0.259±0.044)mmol/L、(2.351±0.303) mmol/L和9.077±0.689]相比較，I/R組和I/R+VSD組在實驗結束后分別為(0.382±0.033)mmol/L和(0.365±0.047) mmol/L、(5.688±1.153)mmol/L和(4.285±0.937)mmol/L、14.890±1.349和11.740±1.001，均顯著性增高(F=4.221，P=0.025，F=16.482，P<0.001和F=20.480，P<0.001)；與I/R組比較，I/R+VSD組LA和LA/PA比值在實驗結束后均顯著性降低(t=3.960，P=0.023和t=4.258，P=0.018)。見圖2。

與假手術組相比：*P<0.05，**P<0.01；與缺血再灌注組相比：ΔP<0.05

與假手術組相比：*P<0.05，**P<0.01；與缺血再灌注組相比：ΔP<0.05

4外周動脈血中血氣值的變化

與假手術組比較，I/R組和I/R+VSD組pH值、AG值在處死前顯著性變化(F=2.260，P=0.040和F=2.562，P=0.032)，但是I/R組和I/R+VSD組之間無顯著性差異(t=1.446，P=0.166和t=1.333，P=0.263)。見表2。

表2 外周動脈血中血氣值的變化

與假手術組相比：*P<0.05，**P<0.01

討論

擠壓傷是多發傷的常見傷[9]，而缺血再灌注損傷是骨骼肌繼發損傷的主要原因[10]。有研究證實[11-12]，長時間能量缺乏會導致線粒體腫脹和細胞壞死，迫使機體采取糖酵解應激代謝為細胞供能[13]，其中HK2、PFK1和PKM1是其限速酶，而PDK4則可通過磷酸化限制PA的完全氧化，經LDHA轉化成為LA以保證ATP的合成[14]。而組織中LA/PA比值、外周血中的pH值和AG值則可以反映局部和全身代謝性酸中毒的程度。

本實驗結果顯示：(1)糖酵解關鍵酶：與假手術組比較，I/R組和I/R+VSD組在實驗結束后的糖酵解關鍵酶均顯著性升高，證實缺血缺氧可上調酶表達，利于應激狀態下為細胞供能；而I/R+VSD組酶的上調更明顯；(2)糖酵解相關酶：與假手術組比較，I/R組和I/R+VSD組在再灌注前和實驗結束后LDHA和PDK4表達顯著性升高，而I/R+VSD組的表達更高提示負壓可以促進上述酶的表達；(3)局部和全身酸中毒指標：①組織內：與假手術組比較，I/R組和I/R+VSD組PA、LA和LA/PA比值在實驗結束后均顯著性增高，提示酸性代謝產物隨著糖酵解增多，堆積在組織內形成局部酸中毒；而I/R+VSD組在實驗結束后上述值均顯著性降低，可能與VSD技術改善局部循環加快轉運有關；②外周血：與假手術組比較，雖然I/R組和I/R+VSD組pH值、AG值在處死前有顯著性變化，但是I/R組和I/R+VSD組之間差異無統計學意義，這與全身強大的酸堿平衡調節有關。

綜上，VSD技術通過上調糖酵解酶的表達，改善應激狀態時細胞的能量代謝和供給，減少了局部酸中毒和pH反常的發生，對機體起到保護作用。本研究為今后通過調節負壓吸引的強度和時間以干預缺血后預處理提供了理論依據。