雙香豆素衍生物的生物活性

楊麗君，丁超 編寫，高川，馮連順 審校

(湖北科技學院核技術與化學生物學院，咸寧 437100)

1 前言

與香豆素一樣，雙香豆素衍生物為苯并吡喃酮類化合物，廣泛存在于天然產物中。雙香豆素衍生物具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗HCV、抗HIV、抗老年癡呆、抗瘧疾、抗真菌、抗結核和抗精神病等多種生物活性，引起了科學家的普遍關注。其中，雙香豆素等已在臨床上作為抗凝血藥物使用，提示這類化合物安全性較高。

本文將著重探討雙香豆素類化合物在抗菌、抗凝血、抗炎、抗病毒、抗寄生蟲和抗腫瘤領域的研究進展，并討論這類化合物的構-效關系(SAR)，以期為進一步合理設計提供理論基礎。

2 抗菌活性

圖1 香豆素及基于香豆素的藥物

細菌感染是院內感染的主要因素，嚴重威脅人類健康。主要的革蘭陽性致病菌有金黃色葡萄球菌/金葡球菌、表皮葡萄球菌/表葡球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌和屎腸球菌等，而典型的革蘭氏陰性致病菌有腸桿菌科如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、銅綠假單胞菌、肺炎衣原體、肺炎支原體、嗜肺性軍團病桿菌和不動桿菌屬等。目前，臨床上使用的抗生素大多發現于上世紀抗生素黃金時代。然而，長時間的使用，致病菌已對抗生素產生了耐藥性，而且愈發嚴重。因此，有必要開發新型抗生素。

Li等研究了一系列單香豆素和雙香豆素衍生物(圖1)的體外抗野生型金葡球菌和3株臨床分離耐甲氧西林金葡球菌(MRSA) XJ 75302、Mu50和USA 300LAC活性，結果發現雙香豆素衍生物1的抗菌活性明顯優于單香豆素衍生物。SAR顯示，R位為烷基取代基的化合物1a,1b(圖2)的抗菌活性高于相應的烷氧基衍生物1c,1d，而向此位置引入鹵素(化合物1e,1f)則可提高這類化合物的抗菌活性；并環結構會導致抗菌活性的大幅下降，如化合物2(最小抑制濃度/MIC: 256μg/mL)活性極弱。值得一提的是，化合物1g(MIC: 2～4μg/mL)對3株所測臨床分離MRSA的活性較高，是對照藥頭孢他啶、頭孢曲松和哌拉西林的16～＞128，而化合物1f對表葡球菌和耐甲氧西林表葡球菌(MRSE)的MIC均為8μg/mL。不幸的是，所有雙香豆素衍生物對革蘭陰性菌大腸埃希菌均為顯示出任何活性，MIC＞256μg/mL。有趣的是，某些衍生物具有潛在的抗腫瘤活性，值得進一步開發。

Muratovi?和Sompornpisut等評價了2個系列雙香豆素衍生物3和4的體外抗金葡球菌和枯草芽孢桿菌活性，結果表明，大多數衍生物具有良好的活性，MIC為1.95～31.25μg/mL。SAR顯示，向苯環的C-4位(3i)和C-5位(4b)引入-Br可提高此類化合物的抗金葡球菌活性，而引入至C-3位(4a)則對活性不利。其中，活性最強的4b對金葡球菌和枯草芽孢桿菌的MIC和最小殺菌濃度(MBC)分別為3.9和1.95μg/mL及7.8和7.8μg/mL，值得深入研究。

為優化兩個香豆素母核之間的連接子，研究人員設計合成了一系列取代吡啶基、酰胺基和吡唑基為連接子的雙香豆素衍生物。結果顯示，這些衍生物的活性明顯弱于相應的次甲基連接子衍生物，絕大多數衍生物5～8(MIC: ≥100μg/mL)未顯示出任何抗菌活性。而以噻吩基(9)、噻唑-吡唑基(10)、亞胺(11)和氧原子(12)作為連接子時，衍生物則顯示出潛在的抗菌活性，提示抗菌活性與連接子息息相關。

有趣的是，將2個或3個雙香豆素揉合到一個分子中所得的化合物13和14也具有良好的抗菌活性，值得進一步研究。

3 抗凝血活性

香豆素類抗凝血藥物如華法林和醋硝香豆醇等能抑制肝臟中的羧化酶，使維生素K依賴因子生成減少，在合成凝血酶原的酶系統中競爭性地置換維生素K，在臨床上有著廣泛的應用。

Manolov等研究了11個雙香豆素衍生物在小鼠模型中的血凝固時間和急性毒性(腹腔注射或口服給藥)，結果顯示，化合物15(圖3)不僅具有良好的體內活性，而且毒性低，可作為先導物進一步優化。

天然產物具有結構和生物活性的多樣性和獨特性，在新藥研發領域占據極為重要的地位。Qin等從紫花地丁中分離得到了雙香豆素衍生物dimeresculetin(16)并研究了其抗凝血活性。與其它雙香豆素相似，該化合物可競爭性抑制維生素K的環氧化物還原酶，阻止維生素K還原成氫醌，進而發揮抗凝血活性。

4 抗炎活性

炎癥是十分常見的基本病理過程，是組織對損傷和異物的正常應答。細胞因子是急性和慢性炎癥過程中不可或缺，而腫瘤壞死因子α(TNF-α)可刺激細胞因子分泌，是慢性炎癥的介質，故TNF-α抑制劑可作為抗炎藥物候選物。查耳酮具有潛在的抗炎活性，而香豆素和查耳酮又均是已知的TNF-α抑制劑，故將二者雜合可能會得到抗炎活性更高的雜合體。

Sashidhara等研究了10個雙香豆素-查耳酮雜合體17(圖4)在角叉菜膠致大鼠足腫脹模型中的體內抗炎活性，結果顯示，其中的3個雜合體17a～17c在口服給藥100mg/kg時可分別抑制29%、26%和33%的炎癥，略弱于相同劑量的對照藥布洛芬(59.5%)；17a～17c對TNF-α的抑制活性呈劑量依賴性，且在400μg/mL時的抑制率分別為47%、43%和21%。不僅如此，這類雜合體在不同濃度時未顯示出任何體內毒性，各項生理指標均正常且存活率高達80～90%。活性最強的雜合體17c還顯示出潛在的抗氧化活性，提示這類雜合體的抗炎活性可能部分源于其自由基清除能力。顯然，雜合體17c可作為先導物進一步研究。

5 抗病毒活性

病毒可在宿主細胞內復制，對人致命的病毒主要有人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、冠狀病毒和流感病毒等。在過去的30年間，香豆素作為口服非肽類抗病毒先導物，引起了研究人員的極大關注。眾多香豆素衍生物對多個抗病毒藥物作用靶點具有親和活性，適當的修飾可明顯的拓展此類化合物的抗病毒譜，值得深入研究。

5.1 抗HIV活性

絕大多數HIV感染患者最終會發展成為艾滋病(AIDS)，并因免疫系統缺陷而死于機會感染和惡性腫瘤。據世界衛生組織(WHO)估計，全球約有4000萬HIV患者，且每年新增200萬，其中＞100萬患者因此喪命。高效抗逆轉錄病毒療法對HIV患者具有良好的療效，但耐藥性的產生使得對新型抗HIV藥物的研發迫在眉睫。香豆素衍生物可抑制HIV-1整合酶(HIV-1 IN)，故有必要研究雙香豆素衍生物的抗HIV活性。

圖2 具有抗菌活性的雙香豆素衍生物1～14的化學結構

圖3 具有抗凝血活性的雙香豆素衍生物15和16的化學結構

圖4 具有抗炎活性的雙香豆素-查耳酮雜合體17的化學結構

Pommier等研究了一系列雙香豆素衍生物的抗病毒活性，其中雙(雙香豆素)衍生物NSC 158393(13)(IC50: 0.8～2.3μmol/L)對HIV-2、貓和猴免疫缺陷病毒整合酶具有良好的抑制活性，而對真核細胞DNA拓撲異構酶I的抑制活性較弱(IC50: 10μmol/L)，提示該化合物逆轉錄病毒整合酶具有一定的選擇性。SAR顯示，該化合物中的-OH和羰基可能是其具有抗病毒活性所必需的基團。進一步研究表明，NSC 158393可同時抑制HIV蛋白酶和整合酶，可作為多靶點抗HIV藥物候選物深入研究。

Zhao等對NSC 158393進行了進一步結構修飾得到了一系列次甲基上含有芳基的雙香豆素衍生物18(圖5)，并評價了它們的抗HIV活性。SAR顯示，R位的取代基為苯基時，對抗病毒活性不利；而用脂溶性更高的芳環取代基代替苯基時，抗病毒活性將有所改善。其中，抗HIV活性最高的雙香豆素衍生物18a(IC50: 4.2μmol/L)的活性與母體NSC 158393(IC50:2μmol/L)相當，可作為先導物進一步優化。

Hsu等研究了2個含有苯胺結構單元的雙香豆素衍生物19a,19b對HIV IN的抑制活性，而苯胺結構單元的引入或許會在香豆素-IN復合物結合位點附近形成共價鍵，進而提高抗HIV活性。然而，研究發現盡管19a,19b(IC50: 43.0和27.4μmol/L)顯示出潛在的抑HIV-1 IN活性，但苯胺結構單元似乎并未在香豆素-IN復合物結合位點附近形成共價鍵，抗HIV活性并未顯著提升，提示在香豆素-IN復合物結合位點附近可能存在一個非親核性或疏水性區域。基于此，向此類化合物中引入疏水基團可能會提高抑HIV-1 IN活性。對母核含有磺酰氧基(20)和苯甲酰氧基(21)的雙香豆素衍生物的抑HIV-1 IN活性測定結果顯示，所有衍生物均顯示出優秀的抑制活性，IC50為0.5～23.7μmol/L。其中，雙香豆素衍生物21的活性優于化合物18，而與NSC 158393相當。SAR顯示，含有芳基取代基的20b～20f和21a～21e(IC50:0.5～3.9μmol/L)優于相應的烷基取代基-Me衍生物20a(IC50: 23.7μmol/L)；磺酰氧基和苯甲酰氧基為高抑制活性所必需。代表物21d抑HIV-1 IN的IC50為0.5μmol/L，是NSC 158393 (IC50: 1.1μmol/L)和18(IC50: 43μmol/L)的2.2和86倍，值得深入評價。而雙(雙香豆素)衍生物22(IC50: 0.49μmol/L)活性優于相應的雙香豆素衍生物，可作為先導物進一步開發。

5.2 抗牛病毒性腹瀉病毒活性

牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)屬于黃病毒科瘟病毒屬，可引起嚴重的家畜疾病。香豆素衍生物可作用于BVDV RNA-依賴性RNA聚合酶，對BVDV顯示出良好的活性。因此，從香豆素衍生物中尋找新型抗BVDV候選物引起了研究人員的普遍關注。

Loddo等評價了C-8位通過不同連接子連接的雙香豆素衍生物23(圖6)的抗BVDV活性，初步活性測試結果顯示，所有衍生物均具有明顯的活性，EC50為0.3～30μmol/L。值得一提的是，代表物23a(EC50:0.3μmol/L)抗BVDV活性是所有對照藥的7～＞333 倍，且對各種細胞系未顯示出毒性(CC50: ＞100μmol/L)，值得進一步研究。

6 抗寄生蟲活性

植物寄生線蟲是臭名昭著的植物病原體，每年導致數十億美元損失。某些香豆素衍生物如呋喃香豆素類和雙香豆素類顯示出良好的殺線蟲活性，故對這類化合物進一步優化有可能得到新型殺線蟲劑。

Qin等研究了6個雙香豆素衍生物24a～24c(圖7)和25a～25c的殺線蟲活性，SAR顯示連接子的長度對活性有顯著影響：對24a～24c而言，長連接子有利于活性，而對25a～25c而言，則恰好相反，短連接子更有利。活性最強的25a對根結線蟲、馬鈴薯塊莖腐爛線蟲、擬松材線蟲、松材線蟲和水稻干尖線蟲等具有廣譜活性，LC50為35.8～190.9μmol/L，但弱于對照藥阿維菌素(LC50: 0.26～0.62μmol/L)。

圖6 具有抗BVDV活性的雙香豆素衍生物23的化學結構

圖7 具有抗寄生蟲活性的雙香豆素衍生物24～27的化學結構

利什曼病是由利什曼原蟲引起的慢性病變，目前已知寄生于人體的利什曼原蟲共3種，即杜氏利什曼原蟲(主要寄生于內臟)、熱帶利什曼原蟲和巴西利什曼原蟲(只侵犯皮膚黏膜)。據估計，全球每年約新增50萬杜氏利什曼原蟲和150萬巴西利什曼原蟲患者。香豆素類化合物具有潛在的抗利什曼蟲活性，值得深入研究。

Rahim等研究了一系列雙香豆素衍生物26的抗利什曼蟲活性，然而約一半左右的衍生物未顯示出任何活性，剩余化合物僅顯示出弱到中等強度的活性，IC50為35.62～82.36μmol/L。SAR研究結果表明，苯環上含有供電子基如-OMe和R1位為-Cl對活性有利。盡管活性最強的雙香豆素衍生物26a(IC50:35.62μmol/L)弱于對照藥噴他脒(IC50: 5.09μmol/L)，但該研究豐富了SAR。

Saeed 等測定了一系列雙香豆素-腙噻唑雜合體27的抗利什曼蟲活性，發現所有雜合體具有潛在的活性(在100μmol/L時，抑制率為40.6～70.4%)。其中，代表物27a在100μmol/L時，抑制率為70.4%，與對照藥兩性霉素B(79.8%的抑制率)相當。SAR顯示，當衍生物苯環含有2個甲基時，無論甲基在任何位置均對活性不利；在苯環間位含有1個甲基時對活性有利；當含有1個強供電子基如-OMe或1個吸電子基如-Cl時，衍生物顯示出中等強度的活性。總之，活性最強的27a可作為先導物進一步優化。

7 抗腫瘤活性

癌癥仍是發達國家排在首位、發展中國家排在第二位的致死性疾病，僅2012年一年全球就約有1400萬人罹患癌癥，其中820萬人死于癌癥相關性疾病。更為嚴峻的是，如果防控不利，在未來的20年中，新發癌癥病例可能增長高達70%。因此，亟需新型抗腫瘤藥物。香豆素類化合物是潛在的抗腫瘤候選物，研究人員設計合成了眾多此類化合物并篩選了它們的抗腫瘤活性。

Zhai等對一系列單香豆素和雙香豆素衍生物的體外抗腫瘤細胞活性研究結果表明，雙香豆素衍生物28(IC50: 15～93.5μg/mL)對所測HUTU80、4T1和PANC1腫瘤細胞系的活性優于相應的單香豆素衍生物(IC50: 97～＞300μg/mL)。對雙香豆素衍生物28(圖8)而言，苯環上含有吸電子基如二氟(28d)或-CN(28c)時對活性有利，而供電子基如-OMe則不利于活性。活性最強的雙香豆素衍生物28d對所測所有腫瘤細胞系的IC50為15～82.5μg/mL，對HUTU80的活性是卡鉑(IC50: 54.3μg/mL)的3.6倍，對4T1和PANC1腫瘤細胞系的活性則與卡鉑(IC50: 52.5和70.1μg/mL)相當。初步的作用機制研究結果顯示，雙香豆素衍生物28d可阻滯HUTU80細胞的S期，誘導細胞凋亡。所有雙香豆素衍生物均顯示出良好的選擇性指數(SI:3.1～7.5)，優于卡鉑(SI: 1.6～1.8)。不僅如此，在小鼠模型中這類化合物未顯示出明顯的急性毒性，在給藥14天時各項生理指標均未發生明顯變化。顯然，此類化合物尤其是28d可作為先導物進一步研究。

基于芳香化酶抑制劑(AI)的內分泌療法對乳腺癌具有潛在的療效，而香豆素衍生物具有潛在的抑制芳香化酶活性，故可用于內分泌療法。Oda等評價了一系列包括雙香豆素衍生物29a,29b在內的香豆素衍生物的抑芳香化酶活性，結果顯示，二者(IC50: 0.0287和7.0μmol/L)尤其是29a顯示出極為優秀的活性，其活性略優于CYP19抑制劑依西美坦(IC50:0.0425μmol/L)，值得進一步開發。

甾族硫酸酯酶是潛在的乳腺癌藥物作用靶點，對12個雙香豆素硫代磷酸鹽30的體外抗甾族硫酸酯酶活性研究結果顯示，這類化合物對源與人胎盤的甾族硫酸酯酶具有良好的活性，IC50為0.86～109.97μmol/L。SAR顯示，R基對活性有顯著影響，且貢獻順序為：-OH ＞ -Cl ＞ -OMe ＞ -NH2。其中，活性最強的30a的IC50為0.86μmol/L，略優于對照藥665-COUMATE(IC50: 1.01μmol/L)。

Perumalsamy等測定了雙香豆素31的抗MDAMB-231、MDA-MB-453和MCF-7細胞系活性，發現該化合物可通過內在的線粒體途徑誘導腫瘤細胞凋亡。該化合物對所測3株腫瘤細胞的IC50分別為5.63、7.30和10.84μg/mL，值得進一步研究。Silva等的研究結果顯示，雙(4-羥基香豆素)32對TNF-α具有良好的抑制活性，IC50為17.5和19.0μmol/L，值得研究。

3個雙香豆素衍生物33對HepG2、HCT-116、MCF-7和Hep-2腫瘤細胞系顯示出優秀的抑制活性，IC50為2.41～8.31μg/mL。SAR顯示，第二個苯基的引入如化合物33b,33c對活性不利。活性最強的33a(IC50: 2.41～6.72μg/mL)可與5-氟尿嘧啶(IC50:2.35～6.56μg/mL)媲美，極具深入研究潛質。

此外，其它一些通過各種連接子連接的雙香豆素衍生物及雙香豆素金屬螯合物也顯示出一定的抗腫瘤活性，盡管絕大多數活性較弱，但豐富了SAR。

8 其它生物活性

除上述活性外，雙香豆素衍生物還具有一些其它生物活性，本部分將進行簡單介紹。

脲酶(又稱尿素酶)不僅為各種微生物的生長提供氮源，在植物萌發過程對氮代謝具有舉足輕重的作用。但土壤脲酶降解尿素肥料太快，導致富營養和氮的流失，故亟需新型脲酶抑制劑。Khan等評價了21個雙香豆素衍生物34(圖9)的抑脲酶活性，結果顯示所有衍生物均顯示出良好的活性，IC50為15.06～91.35μmol/L。SAR顯示，雙香豆素衍生物上的2個-OH可與酶活性位點相結合，負責抑脲酶活性；向C-11位引入任何取代基均對活性不利，故該位點不適合修飾。其中，代表物34a抑脲酶的IC50為15.06μmol/L，略優于標準藥物硫脲(IC50:21.00μmol/L)，可作為先導物進一步研究。

圖8 具有抗腫瘤活性的雙香豆素衍生物28～33的化學結構

雙香豆素衍生物還具有抗氧化活性，某些化合物的活性甚至優于對照藥，如化合物35(IC50:53.33μg/mL)消除自由基的能力高于對照藥丁基羥基甲苯(IC50: 71.00μg/mL)，值得深入研究。

NAD(P)H:醌氧化還原酶1(NQO1)被認為是一種解毒酶，可抑制活性氧的生成，是潛在的抗腫瘤藥物作用靶點。Bryce等研究發現，雙香豆素衍生物36對NQO1具有極為優秀的抑制活性，其中，代表物36a(IC50: 5nmol/L)的活性可與雙香豆素(IC50: 5nmol/L)媲美，值得進一步優化。

Yang等研究發現，從川白芷根部分離得到的(±)-川白芷雙香豆素37可抑制脂多糖活化的RAW264.7巨噬細胞產生一氧化氮，且呈濃度依賴性，IC50為49.6μmol/L，優于吲哚美辛(IC50:61.6.6μmol/L)。進一步研究顯示，該化合物對誘導型一氧化氮合成酶mRNA具有極強的抑制活性，且呈濃度依賴性。

圖9 雙香豆素衍生物34～37的化學結構

此外，某些雙香豆素衍生物還具有控制肥胖、抗補體活性、抑酶活性和作為CB2激動劑的潛力，深入研究仍在進行中。

9 結束語

近年來，研究人員分離和合成了眾多雙香豆素衍生物，并評價了它們的生物活性。本文將著重探討雙香豆素類化合物在抗菌、抗凝血、抗炎、抗病毒、抗寄生蟲和抗腫瘤等領域的研究進展，并討論這類化合物的SAR。

某些雙香豆素衍生物盡管具有潛在的生物活性，但在臨床上使用的這類藥物并不多見，這可能歸結于這類衍生物價格較高、制備較為復雜和生物活性譜較窄所致。有理由相信，通過科學家的不懈努力以上缺點可能會在不久的將來得以解決，使這類化合物為人類健康服務。