抗腫瘤抗生素棘霉素的研究進展

單傳坤，李良

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所，北京 100050)

1 前言

非核糖體肽(nonribosomal peptides, NRP)是一類通過非核糖體途徑合成的代謝產(chǎn)物。棘霉素(echinomycin)是醌霉素(quinomycin)家族中一員，屬于NRP，是鏈霉菌產(chǎn)生的環(huán)肽類次生代謝產(chǎn)物。NRP的合成由多種多功能蛋白復合體完成，其中包括非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)復合體。研究表明，NRPS完成棘霉素大部分的生物合成，同時在生物合成基因簇編輯的具有多種功能的酶的催化下，最終形成具有雙生色團的環(huán)肽類化合物。棘霉素的環(huán)肽骨架由多種不同的氨基酸構成，這種環(huán)肽骨架是由NRPS催化兩條相同的多肽鏈首尾相連而成[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，棘霉素的藥理活性不僅是DNA的嵌入劑，還是乏氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的小分子抑制劑，能夠發(fā)揮抗腫瘤作用。近年來，棘霉素作為一種具有生物學活性的天然產(chǎn)物，其生物合成和抗腫瘤作用機制一直被廣泛研究，本文將從棘霉素的生物合成、抗腫瘤作用機制和應用三方面進行綜述。

1 棘霉素的生物合成

1.1 棘霉素的結構特征

從棘霉素分子結構(圖1)可以看出，其不僅具有環(huán)肽骨架，骨架間半胱氨酸殘基形成硫縮醛結構，還具有兩個特征性喹喔啉生色團結構，該基團是棘霉素抗腫瘤作用的活性基團。

1.2 棘霉素的生物合成

棘霉素生物合成基因簇(Ecm)已經(jīng)被研究者發(fā)現(xiàn)，研究人員提出其合成途徑假說，并且部分合成途徑假說被證實，但其具體的生物合成機制一直在研究中[2-5]。根據(jù)棘霉素結構特征，其生物合成包括生色團的生物合成和環(huán)肽骨架的生物合成。首先是生色團的生物合成。L-色氨酸被廣泛證實為生色團生物合成的起始化合物[5-6]。Watanabe等[2,6-8]首次運用大腸埃希菌作為模式生物體，構建棘霉素生物合成基因并將其導入大腸埃希菌，組裝具有生物活性的非核糖體肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS)復合體，驗證了喹喔啉—甲酰基(QXC)生色團合成途徑假說部分內容(圖2)，由1(L-tryptophan，L-色氨酸)到2(quinoxaline-2-carboxylic acid, 喹喔啉-2-甲酸，QC)。他們預測基因簇中的八個(Ecm2～Ecm4，Ecm8，Ecm11～Ecm14)[4]基因編碼完成從L-色氨酸到QC的轉化。

其次是環(huán)肽骨架的生物合成。QC被加載到由Ecm1、Ecm6、Ecm7編碼的多酶復合體并完成側鏈的延伸，由Ecm7編碼的NRPS上的Ecm TE催化兩條多肽鏈同源二聚化，后面再經(jīng)過環(huán)化，使得兩條肽鏈間的游離巰基空間距離變的更近，經(jīng)過Ecm7 NRPS氧化后，形成3(Triostin A，三骨菌素A)，最后一步，在Ecm18 NRPS中的S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉移酶的催化下二硫鍵變?yōu)榱蚩s醛結構4。并且證明了(2S，3S)β-羥基色氨酸是一個關鍵的中間體。

在生色團合成過程中，有多種特殊功能的蛋白也參與其中。例如ecm8編碼的一種類MbtH蛋白(MbtH-like protein, MLP)[9]對NRPS復合體中腺苷酰化結構域(adenylation, A)的可溶性表達/活性至關重要[10]，而后者直接影響NRPS合成過程中氨基酸的加載。張晨等[3,11]研究細胞色素P450羥化酶對游離的L-色氨酸有無作用時發(fā)現(xiàn)，此羥化酶僅催化已加載到NRPS蛋白的色氨酸殘基進行β-羥化。

通過對棘霉素生物合成機制的研究，不僅能夠了解這類天然活性化合物的代謝過程，還能夠通過對合成途徑進行改造，構建模式生物和天然產(chǎn)物化合物庫[7,12]。

2 棘霉素的作用機制

棘霉素平面結構中包含兩個能嵌入DNA的生色團，因此被稱為DNA的雙嵌入劑。棘霉素與DNA的這種結合是其生物活性的基礎。早期研究中，認為棘霉素與DNA的結合沒有特異性，后來大量X射線衍射[13]、DNA印記和核磁共振波譜實驗證實其對富含GC位點的DNA有結合偏好，這與其他嵌入劑如三骨菌素A和luzopeptin A不同，他們對富含AT位點的DNA有結合偏好。

在當棘霉素與DNA結合后，會抑制拓撲異構酶II[14]，DNA解旋酶[15]和DNA甲基轉移酶[16]的活性，從而抑制DNA的復制和RNA的生物合成。當棘霉素結合的DNA位點為啟動子結合位點時，不同結合部位還能引起不同的生物現(xiàn)象，例如棘霉素能夠特異性抑制HIF-1與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)啟動子中內源性乏氧應答元件的結合[17]，從而抑制乏氧對VEGF mRNA誘導表達的作用。

3 棘霉素在分子生物學研究中的應用

基于棘霉素與生物大分子(核酸和蛋白質)的直接結合作用的應用。

圖1 棘霉素分子結構

圖2 棘霉素生物合成簡圖

Wu等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，棘霉素對T:T錯配隔斷的富含GC的位點有偏好結合，并且其錯配修復缺陷腫瘤細胞抑制作用更強，棘霉素的這一特點未來或許可以用于錯配修復缺陷腫瘤的診斷和治療。DNA雜交生物芯片能實現(xiàn)不同環(huán)境下感染因子的精確檢測，Hakan等[19]在研發(fā)這種芯片時發(fā)現(xiàn)棘霉素與DNA作用能產(chǎn)生氧化信號，并且這種信號強于腺嘌呤和鳥嘌呤產(chǎn)生的信號，棘霉素的引入極大的提高了DNA雜交檢測的靈敏度。Joan等[20]根據(jù)棘霉素與ACGT位點選擇性結合[21]這一特點，運用漲落定理(fluctuation theorems)研究結合反應中能量變化、選擇性和變構效應。

棘霉素不僅能與核酸結合，還能與與蛋白質結合形成復合體。Singh等[22]運用表面等離子體共振(surface plasmon resonance, SPR)技術，證實棘霉素能夠與FKBP12(FK506 binding protein 12, FKBP12)結合，影響mTOR信號通路活性。這也許也是棘霉素抗腫瘤作用的一條信號通路。

4 棘霉素在抗腫瘤等方面的應用

4.1 棘霉素的抗腫瘤作用

Cha等[23]在研究HIF-1α對甲狀腺乳頭狀癌腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響時，發(fā)現(xiàn)他們選擇的四種HIF-1α抑制劑中，棘霉素抑制甲狀腺癌細胞增殖和克隆形成作用最強，在裸鼠動物實驗中，手術剝離瘤塊＋棘霉素化療組也顯示出最高的存活率。Ahn等[24]在舌癌動物模型中發(fā)現(xiàn)，HIF-1手術前后靶向化療能顯著延小鼠的生存時間。Wan等[25]在研究乏氧對膠質母細胞瘤遷移有無影響時，運用棘霉素作為HIF-1的小分子抑制劑，抑制乏氧誘導的Drp1蛋白表達，證明了Drp1蛋白參與乏氧對膠質母細胞瘤U251誘導遷移過程。Thangasamy等[26]在研究乏氧誘導的乳腺癌細胞侵襲作用時發(fā)現(xiàn)，HIF-1能夠與RON啟動子結合，而棘霉素能夠調低RON基因的表達，從而使RON介導的乳腺癌細胞侵襲作用減弱。

Wang等[27]在腫瘤干細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，盡管腫瘤干細胞與正常干細胞有相似性，棘霉素卻能夠選擇性抑制腫瘤干細胞的克隆形成，而不影響骨髓中造血母細胞的克隆形成。這種對腫瘤干細胞的選擇性，也許能夠降低其副作用。隨后，他們在研究急性骨髓性白血病時發(fā)現(xiàn)，棘霉素能夠靶向白血病起始細胞，而對造血干細胞沒有影響[28]。Ponnurangam等[29]在胰腺癌干細胞(Cancer stem cells,CSCs)的研究中發(fā)現(xiàn)，棘霉素能顯著抑制胰腺癌裸鼠移植瘤的生長，并且顯著降低CSCs蛋白標志物的水平。

4.2 棘霉素的其它應用

Janji?等[30-31]在研究乏氧和含羞草素對牙髓源性細胞血管生成素分泌的影響中，棘霉素能減弱細胞對含羞草素和乏氧的響應能力，降低細胞內血管生成素mRNA的水平。他們還運用棘霉素研究牙髓源性細胞的核心生物鐘基因對乏氧和含羞草素的反應性[32]，并發(fā)現(xiàn)細胞蛋白水平和mRNA水平對棘霉素的反應性存在差異。

棘霉素還表現(xiàn)出顯著的抗瘧疾和抗原蟲活性[33-34]，它的抗瘧疾作用的IC50值比氯喹低100倍[35]。

5 棘霉素研究新趨向

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，棘霉素不僅能作用于DNA，更能作用于特定靶點，這其中以其對HIF-1的作用最為突出，大部分研究中，棘霉素都作為靶向HIF-1的抑制劑。有這種新的應用前景，棘霉素也許能夠開發(fā)成靶向HIF-1的藥物。同時，通過對其生物合成過程的研究，構建生物類似物庫，也許能從中發(fā)現(xiàn)毒性更小的化合物。通過對其抗腫瘤作用機制和應用的研究，將來或許能找到更多的作用靶點。通過改變其給藥劑型，也許能夠降低其體內毒性，在臨床研究中走的更遠。