北京市腹瀉兒童人博卡病毒VP1區基因特征分析

吉彥莉，王永全，崔海洋，靳 博

感染性腹瀉是全球兒童常見傳染病，是5歲以下兒童死亡的第二大原因。在我國，感染性腹瀉的發病率一直位居腸道傳染病的首位，疾病負擔嚴重[1-3]，已納入《中華人民共和國傳染病防治法》管理。研究表明，病毒是引起嬰幼兒感染性腹瀉的最主要原因，其中，諾如病毒、輪狀病毒、腸道腺病毒和星狀病毒是4種最常見的致瀉病毒[4-5]，同時也是病毒性腹瀉常規監測項目。但是，仍有近50%的兒童急性腹瀉病原不明確[6-8]。

人博卡病毒（human bocavirus,HBoV）是瑞典學者Allander于2005年發現的一種細小病毒[9]，是單正鏈無包膜DNA病毒，基因組全長約5.6 kb，目前共發現4種型別（HBoV1～4型）。因HBoV在急性腹瀉糞便中頻繁檢出[10-12]，引起了國內外學者的關注，多項病例對照研究都證明了其與腹瀉的相關性[13-14]。作為一種新發腹瀉相關病毒，

HBoV尚未被納入常規腹瀉病原學監測，相關研究在我國亦不多見。本研究通過對北京地區急性腹瀉兒童HBoV的感染狀況及基因進化特征的研究，為兒童病毒性腹瀉的防控提供依據。

1 資料與方法

1.1 資料來源 2015年11月 2016年12月，采集哨點醫院（北京大學第一醫院、北京市兒童醫院）門診就診的急性腹瀉兒童糞便標本。患兒年齡＜5歲，發病時間＜3 d，就診主訴為嘔吐或腹瀉等消化道癥狀。

1.2 標本前處理 將糞便標本與PBS充分震蕩混勻，制成10%的糞便懸液，8000 rpm離心5 min，取上清液備用。

1.3 HBoV檢測 用QIAamp? MinElute Virus Spin Kit（Qiagen）提取病毒核酸，通過巢式PCR擴增HBoV VP1區部分序列，引物序列見表1，反應條件參照文獻[13]。目的片段條帶為567 bp，用QIAxcel Advanced毛細管電泳進行檢測。PCR陽性產物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行純化回收及序列測定。

1.4 HBoV進化分析 將測序結果通過 BLAST比對確定病毒型別。下載Genbank中不同型別和亞型、不同地域及不同時間分布的HBoV序列，作為參考序列。用 Vector NTI AlignX計算毒株間序列相似性。用MEGA7進行序列和進化分析，用鄰接法構建進化樹，用Kimura雙參數模型計算遺傳距離。

表1 HBoV巢式PCR引物Table 1 Nested PCR primers for HBoV

2 結 果

2.1 腹瀉兒童基本情況 2015年11月 2016年12月，共收集到396例5歲以下腹瀉兒童糞便標本。患兒中，男223例，女173例，男女比例為1.29∶1。患兒最大月齡58個月，最小為0個月，月齡中位數為12個月。

2.2 HBoV的檢出情況 共檢出HBoV 30例，總檢出率為7.58%。其中，HBoV1型檢出17例，檢出率為4.29%；HBoV2型檢出11例，檢出率為2.78%；HBoV3型檢出2例，檢出率為0.51%，未檢出HBoV4型。

2.3 HBoV序列分析 將30例HBoV北京株（基因型別為：HBoV1、HBoV2及HBoV3）VP1區序列與Genbank中的序列進行BLAST比對。序列分析顯示30例HBoV北京株在VP1區核苷酸序列相似性為71%～100%，氨基酸序列相似性為85%～100%。其中，17例HBoV1北京株序列相似性為96%～100%，與HBoV1參考序列相似性為98%～99%；11例HBoV2北京株序列之間相似性為96%～100%，與HBoV2參考序列相似性為91%～99%；2例HBoV3北京株序列相似性為99%，與HBoV3參考序列相似性為97%～98%。

2.4 HBoV分子進化分析 系統進化樹顯示，HBoV包括4個進化樹分支，分別為HBoV1、HBoV2、HBoV3和HBoV4。本研究中的所有序列均位于HBoV1～3型分支上（圖1）。其中，HBoV1型北京株分支包括兩簇：BJ16-325自成一簇，與其他HBoV1型序列差異達4%；其余HBoV1型序列高度同源（相似性為98%～99%），共同構成一簇。HBoV1 VP1區氨基酸序列比對分析也表明，BJ16-325與其他HBoV1型北京株相比，氨基酸特異變化位點最多，為4個（圖2），表明BJ16-325出現了較高程度的變異。

既往國內外報道將HBoV2分型為HBoV2A和HBoV2B 2個亞型。而本研究顯示，HBoV2型序列在進化樹上包括3個亞型分支（bootstrap＞90），本研究中所有HBoV2型北京株序列均獨立于HBoV2A和HBoV2B亞型，位于一個新的亞型分支上。同源性分析表明，本研究中的HBoV2型北京株與HBoV2A、HBoV2B亞型間相似性分別為91%～93%及92%～93%，低于HBoV2A和HBoV2B亞型間的相似性（95%～96%）。此外，通過kimura-2-parameter模型計算遺傳距離發現，該HBoV2北京株序列與HBoV2A、HBoV2B亞型參考序列間平均遺傳距離分別為0.079和0.081，均高于2A與2B亞型之間的平均遺傳距離（0.045），由此表明該HBoV2型北京株序列為HBoV2的一個新的亞型。

圖1 北京地區HBoV生物進化樹Figure 1 Phylogenetic tree of HBoV in Beijing

3 討 論

嬰幼兒是急性感染性腹瀉的高發人群，發病率和病死率高，是值得關注的公共衛生問題。2005年Allander首次發現了HBoV，之后不斷有學者從腹瀉糞便中檢出HBoV。本研究顯示，北京地區5歲以下急性腹瀉兒童HBoV檢出率為7.58%，與重慶、上海等地結果相似[15-16]。因時間、地域、人群免疫力及檢測方法等不同，HBoV檢出率可出現較大差別[17-18]。

圖2 HBoV1北京株VP1區部分氨基酸序列比對Figure 2 Amino acid sequence alignment of partial VP1 region of HBoV1 Beijing strains

HBoV包括HBoV1～4 4種基因型，其中HBoV3型和HBoV4型檢出率低，較為少見。本研究中檢出的HBoV北京株包括HBoV1、HBoV2和HBoV3 3種型別。從進化樹上可以看到，北京地區的1株HBoV1序列BJ16-325在進化樹上自成一簇，且與HBoV1其他序列變異程度相對較大，差異達4%。而Zhao等[19]對當地連續8年腹瀉病例HBoV的進化研究表明：HBoV1在VP1區高度保守，8年間所有HBoV1毒株在VP1區的變異僅為1%。這表明北京地區至少存在2組不同來源HBoV1毒株的流行。此外，值得注意的是，以往國內外報道將HBoV2分為HBoV2A和HBoV2B 2個亞型。而本研究中檢出的所有北京地區HBoV2序列均不屬于HBoV2A和HBoV2B亞型，而是位于一個新的HBoV2亞型分支上，表明北京地區HBoV2流行株為近年來出現的一種新的亞型。

有研究表明，HBoV存在型間重組[20]，Zhao等[19]報道了HBoV2A和HBoV2B存在亞型間重組。病毒序列重組可導致新的型別及亞型的出現，還可能導致病毒毒力及抗原性的改變。本研究中，北京地區流行的HBoV2毒株為一個新的亞型，其是否來源于HBoV序列的重組變異還須要進一步研究。