非洲豬瘟疫苗研究進展

何 洋，康樺華，馮銹華，向 華，陳 晶，黃 忠，袁子國，王曉虎

非洲豬瘟（African swine fever,ASF），是以非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）為病原所引起的急性、熱性、高傳染性、超高致死性的疾病，一旦發病，無藥可治，病死率可達100%，屬于國際動物衛生組織A類疫病，也是我國一類疫病之一[1]。ASFV是一種巨大的20面體結構的DNA病毒，其基因組為線性雙鏈DNA分子，不同分離株的大小存在差異，長度在170～193 nm之間。由于ASFV介于痘病毒與虹膜病毒之間的特征，研究者將其劃分為非洲豬瘟病毒屬，且是惟一成員[2]。ASFV主要依賴巨噬細胞及網格蛋白介導的內吞作用進入宿主細胞，以宿主巨噬細胞為靶細胞[3-4]。根據其毒力差異，可分為高致病性、中等毒力、低毒力及感染無臨床癥狀的毒株。

ASF首次報道于1921年。1909 1915年東非暴發了一種由病毒所引起的針對家豬的致命性疾病，當時認為這是一種由豬瘟病毒變異所導致的疾病，因該病多發生于復雜的非洲野生環境中，故研究者將野生動物，特別是疣豬視為主要的傳染源[5]。后來研究發現，ASF是由在疣豬巢穴內生長的一種攜帶ASFV的軟蜱持續傳播所致，ASFV是一種以蟲媒介為主要傳播方式的病毒[6]。在20世紀上半葉，ASF僅肆虐于東非以及南非部分國家，對該地區的家豬養殖業造成了極大的沖擊[7]。1957年，ASF以安哥拉為跳板，首次進入了歐洲國家，雖然很快在葡萄牙的里斯本地區被撲滅，但未能將其徹底根除，在之后很長一段時間內流行于撒丁島。直至1995年，隨著西班牙疫情的撲滅[8]，歐洲范圍內的ASF疫情才得以控制。然而，野豬作為ASFV的攜帶者，其生活習性為病毒的傳播與流行提供了極大助力，使得ASF在2007年再度流行，并進一步向東歐、美洲和亞洲蔓延[9]。2018年8月我國暴發了第一起ASF疫情，并逐步在我國境內蔓延。目前針對ASF，尚未研制出能提供全面保護的疫苗。本文主要針對ASF的疫苗研制實驗進行綜述，以期為ASF的防治提供思路與方向。

1 滅活疫苗

滅活疫苗，是通過物理或化學手段，使病原微生物喪失感染性與毒性，又保留免疫原性的一類疫苗。ASF疫苗的生產最初也嘗試利用這種經典的疫苗制備手段，但遺憾的是，利用感染ASFV的豬肺泡巨噬細胞或者感染脾臟勻漿所制備的滅活疫苗既無法檢測到血清學反應，也未能產生針對同源病毒的保護性免疫。而接種經純化或超聲處理的感染細胞所制備的滅活疫苗后，雖然確實能夠誘導接種動物產生抗體，且可以從血清中檢測到，但是依然無法保護接種動物免受病毒侵害[10-11]。

如果說滅活疫苗自身免疫原性的缺陷是導致機體出現較弱甚至不產生免疫應答現象的原因，那么與免疫佐劑聯用的效果又如何呢？Blome等[12]利用最先進的免疫佐劑Polygen TM與Emulsigen重新分別與滅活ASF疫苗聯用，評估結果仍然與之前類似，即雖然可以誘導實驗動物產生相應的抗體，但是卻不能與ASFV發生中和反應，自然也無法使接種動物獲得免疫性保護，同時在實驗的過程中發現過高的抗體水平反而可能會影響疫苗的功效。目前看來，由于抗體在ASF中的免疫保護作用尚不清楚，故滅活疫苗的使用還須更進一步地探討與研究。

2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是一種經典的傳統疫苗，它是通過自然篩選或人工致弱等手段處理后培養制備的弱毒株。由于弱毒活疫苗利用方便，成本低廉，免疫原性好，免疫期長的特點，一直屬于主流的流行病防控手段[13]。研究者針對ASFV的弱毒疫苗研制主要可分為兩大類，即天然弱毒疫苗與人工弱毒疫苗。

2.1 天然弱毒疫苗 ASFV/NH/P68與OUR/T88/3是ASFV的兩類天然弱毒株。其中ASFV/NH/P68能夠促進細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）與NK細胞的活性，并且經ASFV/NH/P68免疫后的家豬可以抵御ASFV/L60強毒株的攻擊[14-15]，但是會引起部分免疫豬出現慢性感染的現象。

經OUR/T88/3免疫的家豬，能夠抵御OUR/T88/1毒株的攻擊，但是隨著CD8+T淋巴細胞的消耗，也會使免疫效果減退，造成對OUR/T88/1毒株的不完全保護[16]，提示CD8+T淋巴細胞在ASFV的保護性免疫中占重要角色。受OUR/T88/3免疫的家豬，同樣能夠對Benin 97/1分離株與genotype X Uganda分離株產生免疫[17]，表明利用OUR/T88/3毒株制備具有交叉保護作用的疫苗具有可行性。在不同區域以不同劑量的OUR/T88/3免疫動物，可產生不一樣的免疫效果，它們的差距甚至達到了1.5～2.0倍，提示免疫方式與劑量也會對免疫效果造成影響[18]。與一般的天然弱毒疫苗免疫接種動物后造成或輕或重的不良反應一樣，受OUR/T88/3免疫的動物會出現發熱、關節腫脹等臨床癥狀[16-18]。天然弱毒疫苗存在的生物安全風險限制了其作為防控疫苗的實際使用價值與可行性。

2.2 人工弱毒疫苗 人工弱毒疫苗又可以分為傳代致弱毒活疫苗與重組致弱毒活疫苗。ASFV可在豬源細胞系如Vero與CV1內不斷傳代，降低其毒力。然而由于病毒外膜脂質的差異，之前可產生中和反應的血清對以傳代方式降低毒力的毒株不再具備好的中和活性[19]。歷史上，在西班牙與葡萄牙兩國，都曾有過利用傳代致弱毒株免疫動物卻產生災難性后果的記錄，所免疫動物呈現出急性與慢性的ASF癥狀，大量死亡，而存活下的動物也多數攜帶ASFV，成為之后ASF疫情的傳染源，這種情況導致了傳代致弱毒活疫苗開發與應用的延滯[20]。

雖然目前關于傳代致弱毒活苗的開發并不樂觀，但是依然有不少的研究小組在進行嘗試。Krug等[21]將ASFV-G（佐治亞共和國株）在Vero細胞中連續傳代后發現，隨著傳代次數增多，毒株毒力不斷下降，在第110代完全喪失毒力，并且不能賦予免疫動物對ASFV-G的免疫。同時其在原代豬巨噬細胞內的增殖能力下降，而在Vero細胞內的增殖能力隨傳代次數增多而增強。Lacasta等[22]則發現，將用強毒E75在CV1細胞系上傳代致弱的E75CV1毒株進行免疫后發現，弱毒株產生了與親本截然不同的免疫途徑，并且E75CV1能免疫同源E751的攻擊，但不能對異源毒株BA71產生保護性免疫。目前來看，傳代致弱毒活疫苗雖然仍存在生物安全問題，但同樣有機會成為抗ASFV的候選疫苗之一。

重組致弱毒活疫苗則是利用分子生物學技術對病毒的基因、結構進行改變來實現病毒毒力的減弱，以此開發的對機體低毒性而又能長期免疫的疫苗。ASFV入侵機體總伴隨著各種逃避宿主免疫反應的分子機制，比如通過A238L蛋白來抑制T細胞中NF-κB和核激活因子，或者由EP402R和EP153R基因編碼的CD2v凝集素樣蛋白調節宿主的防御，亦或通過多基因家族蛋白（MGF505-2R）改變干擾素的產生[23]。

科學家們則以此為方向，利用分子生物學手段，嘗試制備重組致弱毒活疫苗。Borca等[24]構建了CD2樣蛋白8-DR缺陷性ASFV毒株，并檢測其功能變化，研究發現雖然未降低毒株毒力，但是能抑制宿主的免疫活性，提示8-DR參與了病毒早期的感染過程。Abrams等[25]則將OUR/T88/3中的DP71L與DP96R基因敲除，使其毒力降低，并構建了缺陷性毒株OUR/T88/3DeltaDP2。免疫后發現相較于親本OUR/T88/3的免疫效果來說，缺陷性毒株產生的免疫保護效果僅為66%。這提示毒株毒力的強弱可能會影響其免疫保護的效果。Vivian等[26]則利用ASFV-G毒株構建了B119L基因缺陷性ASFV-G-Δ9GL，發現低劑量的缺陷性毒株不僅不會誘發毒性反應，甚至在感染第21 d與28 d分別賦予了機體部分及完全性的免疫保護。Reis等[27]以Benin 97/1為模板分別構建了MGF530及MGF360缺陷性毒株BeninΔMGF，研究發現所有免疫豬除了有發熱癥狀外無其他臨床癥狀，并且都能抵御Benin 97/1的攻擊，而在接種缺陷性毒株后，以OUR/T88/3株加強免疫，仍有75%的免疫保護效果。

IFN調節的缺失，也是構建減毒ASFV毒株的思路之一。O'Donnell等[28]在之前的實驗基礎上，敲除了基因UK（DP96R），發現可以實現高劑量下的無毒性誘導，僅僅兩周就能夠實現對ASFV-G 2007分離株的免疫。可以說是目前為止最為成功的實驗性弱毒活疫苗。以此看來，部分重組致弱毒活疫苗已經實現了一定程度的生物安全保證，但是敲除的基因是否會對病毒造成其他影響而導致免疫失效仍須要繼續驗證。

3 核酸疫苗

核酸疫苗是一種利用病原體的抗原基因與真核表達載體重組構成的質粒，當其轉入動物體內時，能表達病原體的有效抗原成分，引起保護性免疫[29]。有嘗試利用核酸疫苗抗ASFV感染的研究，但是卻因核酸疫苗在大型動物體內免疫原性不樂觀的情況而備受爭議。隨著對ASFV的深入研究，發現CD8+T細胞效應是ASFV免疫過程中的關鍵[30]。為了加強核酸疫苗的免疫原性，Argilaguet等[31]通過將ASFV基因P54與P30串聯為PQ后與豬白細胞抗原II的抗體可變片段框APCH1融合，構建成新的質粒pCMVAPCH1PQ，雖然可以令豬對抗原的免疫應答能力成倍增強，但無法針對致死性ASFV提供免疫性保護，也無法產生中和反應。Argilaguet等[32]將ASFV基因P54與P30，ASFV血凝素（sHA）的決定簇及泛素融合，構建了新的質粒載體pCMVUbsHAPQ，旨在增強誘導CTL的效應。該質粒成功誘導了豬的體液與細胞免疫，并且使部分免疫豬在致死性ASFV-E75的攻擊下得到保護。這提示細胞免疫與預防ASF密切相關。該課題組還發現，通過表達文庫可使約60%的免疫豬免于ASFV-E75的攻擊，提示單一的基因表達免疫僅能提供有限的保護能力，而ASFV基因組中還存在著其他影響免疫應答的因素[33]，仍須要更進一步地深入研究。

4 亞單位疫苗

亞單位疫苗多是利用病原體不含核酸的表面抗原，誘發機體產生抗體的一種疫苗。科研人員利用昆蟲桿狀病毒表達系統，表達了ASFV的P12蛋白，實驗發現重組表達P12蛋白能夠以劑量依賴的形式抑制多種ASFV分離株在體外豬肺泡細胞上的增殖復制，但是卻無法提供免疫性保護[34]，這提示P12作為ASFV的附著蛋白影響了病毒的早期感染。ASFV的P72蛋白、P54蛋白及P30蛋白的抗體，能夠在病毒攻擊易感細胞后中和病毒，抑制病毒的依附、復制及內化的過程[34]。雖然分別利用桿狀病毒表達系統表達P30蛋白、P54蛋白、P72蛋白及P22蛋白都可以有效誘導機體產生中和抗體，但是并不能提供有效的免疫保護，而當聯用P30蛋白與P54蛋白共同免疫時，卻產生了不同程度甚至完全性的免疫保護[35-37]。這表明單一抗原引起的免疫應答不足以提供全面的保護，由抗體介導的保護作用之間也存在互補的關系。近年來，通過將載體表達ASFV抗原引發免疫原性作為首免，然后利用減毒活疫苗加強免疫的策略，擴寬ASFV表位的識別，這也是一種亞單位疫苗與傳統疫苗聯用的防治思路[38]，因此，鑒定更多的ASFV保護性抗原，開發新型的免疫佐劑，都是提高ASFV基因工程亞單位疫苗免疫效力的可行思路。

5 病毒活載體疫苗

許多研究表明，細胞免疫在抗ASFV中扮演重要角色，而CTL的效應更是免疫效果的保證[31-33]。因此，有學者利用病毒活載體可在機體內持續復制與表達的特性，研制以腺病毒、甲病毒為載體重組ASFV部分抗原基因的病毒載體疫苗。Lokhandwala等[39]構建了混合ASFV-P32、P54、P62和P72抗原的腺病毒載體疫苗，獲得了較好的抗原特異性CTL應答。而Murgia等[38]則利用甲病毒載體，分別構建表達ASFV p30（RP-30）、p54（RP-54）、pHA72（RP-sHA-p72）的抗原載體，并且在Vero細胞中獲得的重組病毒RP-30具有較好的免疫原性。目前關于病毒活載體疫苗的安全性仍須要通過攻毒保護實驗來進一步驗證。

6 展 望

隨著科學技術的不斷發展與進步，針對ASF的防治疫苗，也從開始的滅活疫苗嘗試，向針對病毒感染宿主的特定機制入手。雖然在ASFV功能結構、入侵方式及宿主對ASFV的免疫應答方面取得不少成果，并以此嘗試了多類別的疫苗開發而獲得了一定效果，但是，仍然無法改變尚無有效疫苗可用的現狀。目前看來，弱毒活疫苗由于能在保留病毒較完整結構的前提下，最大限度的降低毒力，并且可在機體內復制，持續誘導中和抗體產生，成為可提供高效、安全的保護性疫苗的首選。但是，它的缺點也同樣無法忽視，如復雜環境下可能出現的毒力返強現象，對易感動物的攻擊性等都是必須要面對的生物安全問題。

我們對目前ASF滅活疫苗、弱毒活疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗以及病毒活載體疫苗的研究進展及其優缺點進行簡要匯總（表1）。此外，除了利用疫苗作為對抗ASFV手段，也有直接針對病毒轉錄復制過程來抑制病毒增殖的手段，例如利用RNA干擾技術，敲降ASFV的A151R和VP72基因，抑制病毒的體外復制能力[40]，或者利用有機試劑氟喹諾酮，金雀異黃酮直接阻斷ASFV DNA的復制，干擾其復制周期，達到抑制病毒增殖的目的[41-42]。這些都為ASF的防治提供了新的手段。從長遠來看，高效安全的特異性疫苗仍舊是防治ASF的最佳手段，因而更高效的免疫佐劑探索，更可靠的生物安全風險控制，更寬廣的抗原位點識別研究以及多種疫苗的相互聯用，都是今后值得關注的研究方向。

表1 ASF各種候選疫苗優缺點比較Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of various candidate vaccines for ASF