甘露寡糖對泥鰍生產性能、腸道菌群和非特異性免疫功能的影響

杜宗君，蘇 健，巫紅萍，王雪力，鄧 濤，曾麗雯，徐華明，武佳韻，溫安祥*

（1.四川農業大學動物科技學院，成都611130；2.四川農業大學生命科學學院，四川 雅安625014）

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）屬溫水性底棲小型魚類，具有較好的食用和藥用價值。國內外旺盛的市場需求，促進了泥鰍養殖業的快速發展。但泥鰍生長速度相對緩慢，苗種成活率低。高密度養殖引起的應激反應也導致魚體抗病力下降。為防控病害，在水產養殖中普遍使用抗生素，由此產生的抗藥性和藥物殘留等食品安全問題已引起人們的高度重視。研發綠色無毒、低成本的高效促生長劑或免疫增強劑，提高泥鰍的生長速度和成活率，減少抗生素的使用，已成為推動泥鰍養殖業健康發展的重要舉措之一。

甘露寡糖（mannose oligosaccharides,MOS）是一種從酵母細胞壁中提取的磷酸化葡萄糖與甘露糖結合的復合物，具有無毒副作用、無污染殘留、不產生耐藥性且可部分替代抗生素等特點。已有研究表明，甘露寡糖可提高非洲鯰魚[1]、鯉魚[2-5]、大西洋鮭[6]、羅非魚[7-8]、金頭鯛[9]、黃顙魚[10]、斑點叉尾鮰[11]、舌齒鱸[12]和草魚[13]等魚類的生產性能和抗病力[14]。但李富東[15]的相關研究中卻發現甘露寡糖對牙鲆的生產性能、消化酶、血清溶菌酶活力和白細胞吞噬活性均沒有顯著影響。徐磊等[16]的研究表明甘露寡糖對異育銀鯽的生產性能影響不明顯，但能顯著提高異育銀鯽血清堿性磷酸酶活性、球蛋白濃度和總抗氧化能力，增強其對嗜水氣單胞菌感染的免疫保護。迄今未見甘露寡糖對泥鰍生產性能和免疫功能的研究報道。本試驗擬探索在飼料中添加甘露寡糖對泥鰍生產性能、腸道菌群和非特異性免疫功能的影響，以期為泥鰍健康養殖實踐中科學利用甘露寡糖提供參考，同時為進一步探索甘露寡糖的作用機理提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗泥鰍購自四川省成都市雙流縣萬福水產養殖場。將購回的魚種用1.5% NaCl消毒10 min，飼養于四川農業大學生命科學學院動物實驗室。試驗所用基礎飼料配方見表1。常規飼料原料購自四川農業大學動物營養所，預混料購自廣州白云牧之林動物藥廠。

表1 基礎飼料組成及營養水平（風干基礎）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis)

1.2 試驗設計

用基礎飼料馴養14 d，選擇初重為（3.27±0.05）g的健壯泥鰍360尾，隨機分為6組，每組3個重復，每個重復20尾，置于60 cm×45 cm×45 cm的玻璃缸中飼養。在基礎飼料中分別添加0、100、200、400、600和800 mg/kg甘露寡糖（四川成都禾日生物科技有限公司，飼料級，干基≥70%），配制成6種飼料。微量組分采用逐級擴大法加入基礎飼料。用水將飼料揉和成團，每天按魚體重的2%～3%定時（09:00、18:00）投喂。每次投喂前采用虹吸法清除殘餌，并補充適量新水。試驗期水深20 cm，水溫為22～28℃，室內自然光照。試驗期70 d。

1.3 樣品采集

試驗結束時禁食24 h，測定泥鰍的體長和體重；從每一重復中隨機撈取10尾泥鰍，自尾靜脈采血，0.5%肝素鈉抗凝。將每2尾泥鰍的抗凝血等量混合，4℃下3 000 r/min離心10 min制備血漿。解剖并迅速分離肝胰臟，與預冷0.65% NaCl溶液按1∶9體積比混合，4℃下勻漿，將勻漿液3 000 r/min離心10 min，取上清液。測量腸道長度，稱取腸道重量，收集腸道內容物。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生產性能測定

成活率（SR）=終末尾數/初始尾數×100%

特定生長率（SGR）=（ln終末體質量-ln初始體質量）/試驗天數×100%

肥滿度（CF）=體重/體長3×100%

餌料系數（FCR）=投食飼料總質量/（終末體質量-初始體質量）

腸體指數（IWI）=腸重/體重×100%

腸長指數（ILI）=腸長/體長×100%

1.4.2 腸道菌群檢測

采用點種法檢測腸道大腸埃希菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌[17]。將腸道內容物以滅菌生理鹽水倍比稀釋為10-1～10-6，然后用微量進樣器分別取稀釋液0.02 mL，滴入各種培養基，即大腸埃希菌用伊紅-美藍培養基（EMB），乳酸桿菌用MRS培養基，雙歧桿菌MRS+X-gal培養基。每個重復做3個稀釋度（大腸埃希菌選擇10-3、10-4、10-5；乳酸桿菌選擇10-4、10-5、10-6；雙歧桿菌選擇10-4、10-5、10-6），每個稀釋度做3個平行。大腸埃希菌需氧培養24 h，乳酸桿菌、雙歧桿菌厭氧培養72 h，分別計數大腸埃希菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數量。菌群數量以每克腸道內容物所含細菌群落總數的對數[（lg CFU）/g]表示。

1.4.3 非特異性免疫指標測定

采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒檢測溶菌酶（lysozyme，LZM）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等非特異性免疫指標。

1.5 數據處理

試驗結果用“平均數±標準差”表示，采用SPSS 20.0軟件進行數據分析和統計，先對數據作單因數方差分析（ANOVA），若組間差異顯著，再用Ducans多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 甘露寡糖對泥鰍生產性能的影響

據表2所示，100～600 mg/kg組泥鰍的特定生長率顯著高于對照組和800 mg/kg組（P＜0.05）；100～800 mg/kg組泥鰍的肥滿度均顯著高于對照組（P＜0.05），其中200 mg/kg組最高；200和400 mg/kg組的餌料系數顯著低于對照組、100、600和800 mg/kg組；各試驗組泥鰍的成活率與對照組相比均有所提高，但差異不顯著（P＞0.05）。

表2 甘露寡糖對泥鰍生產性能的影響Table 2 Effect of mannan-oligosaccharides on production performance of M.anguillicaudatus

2.2 甘露寡糖對泥鰍腸道發育和腸道主要菌群的影響

從表3可知，添加甘露寡糖的各試驗組泥鰍的腸體指數和腸長指數均顯著大于對照組（P＜0.05），其中200 mg/kg組的腸體指數和腸長指數最大；200～800 mg/kg組大腸埃希菌數量顯著低于對照組（P＜0.05）；各甘露寡糖組泥鰍的腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌數量均顯著大于對照組（P＜0.05），其中200～600 mg/kg組乳酸桿菌數量顯著高于低添加劑量的100 mg/kg組和高添加劑量的800 mg/kg組（P＜0.05），200～400 mg/kg組雙歧桿菌數量顯著高于低添加劑量的100 mg/kg組和高添加劑量的600 mg/kg組、800 mg/kg組（P＜0.05）。

2.3 甘露寡糖對泥鰍非特異性免疫的影響

添加甘露寡糖對泥鰍血漿和肝胰臟SOD、CAT及LZM等非特異性免疫指標的影響見表4。肝胰臟和血漿SOD、CAT活性，以及血漿LZM含量均隨甘露寡糖添加量地增加而提高，添加200 mg/kg或400 mg/kg時達到最高水平。200 mg/kg組、400 mg/kg組血漿和肝胰臟SOD、CAT活力較對照組顯著提高（P＜0.05）。各甘露寡糖組血漿LZM含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。

表3 甘露寡糖對泥鰍腸道發育和腸道主要菌群的影響Table 3 Effects of mannan-oligosaccharides on intestinal development and intestinal microflora in M.anguillicaudatus

表4 甘露寡糖對泥鰍血漿和肝胰臟SOD、CAT及LZM的影響Table 4 Effects of mannan-oligosaccharides on SOD，CAT and LZM in plasma and hepatopancreas of M.anguillicaudatus

3 討論

3.1 甘露寡糖對泥鰍生產性能和腸道菌群的影響

自T.Yoshida等[1]率先報道甘露寡糖能顯著提高大西洋鮭抗病力以來，有關甘露寡糖對魚類生長性能和腸道菌群影響的研究也陸續開展。李云蘭[2]、李洋[5]等添加甘露寡糖顯著提高幼建鯉的增重率、降低餌料系數，顯著提高腸道重量與長度、腸道乳酸桿菌與雙歧桿菌數量，降低大腸埃希菌數量。還有眾多研究表明，在飼料中添加甘露寡糖對試驗動物的促增重效果明顯[4，7，11，13]，促進腸道乳酸桿菌增殖并抑制大腸埃希菌定植[8]，提高前、后腸皺襞高度和小腸絨毛密度、寬度與高度[5，7]。這些研究表明，甘露寡糖的促生長作用可能與其顯著促進腸道發育，改善腸道微生態環境有關。

本試驗在飼料中添加200、400 mg/kg甘露寡糖，顯著提高了泥鰍的特定生長率和肥滿度，降低了餌料系數；顯著提高了泥鰍的腸體指數、腸長指數；顯著促進了腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖，對大腸埃希菌有極顯著的抑制作用。表明在泥鰍飼料中添加200～400 mg/kg甘露寡糖，可促進泥鰍腸道發育，優化腸道微生態環境，從而促進其生長。本試驗結果與前述李云蘭[2]的研究結論一致。但李富東[15]、徐磊等[16]發現甘露寡糖對牙鲆和異育銀鯽的增重率和餌料系數等均沒有顯著影響。

甘露寡糖影響腸道菌群的作用機理已比較清楚[18]。從結構上看，甘露寡糖1,4糖苷鍵極少，因此不易被魚類消化吸收，直接進入魚類后腸作為乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌群的特異性營養基質，促進有益菌群增殖，而有益菌群的代謝產物能通過降低腸道pH或者通過在空間、營養上的競爭性屏蔽作用來抑制有害菌在腸道上的定植和生長，保證消化道菌群的平衡。對甘露寡糖促生長效應的研究結果尚不一致，還不清楚是否因魚的種類、添加甘露寡糖的時期（魚類生長階段）、添加劑量和連續飼喂甘露寡糖的時間等因素所致。總之，甘露寡糖的促生長機理還有待于進一步深入研究。

3.2 甘露寡糖對泥鰍非特異性免疫功能的影響

已有研究表明，在飼料中添加適量甘露寡糖，能提高試驗動物脾臟指數[4]、白細胞吞噬活性[4-5，10]、血清總蛋白含量[13]、球蛋白濃度[16]、血清溶血素活力和血清殺菌百分率[4]，增強血清溶菌酶[2，10]、堿性磷酸酶[7，13，16]、超氧化物歧化酶[7]活性和總抗氧化力[7]，增強魚類的非特異性免疫功能，提高其成活率[2，11，16]。

本研究顯示，添加200或400 mg/kg甘露寡糖，顯著提高了肝胰臟和血漿SOD、CAT活性及血漿LZM含量，表明添加適量甘露寡糖（200～400 mg/kg）可增強泥鰍的非特異性免疫功能。與前述李云蘭等的研究結論一致。但李富東[15]試驗發現添加甘露寡糖對牙鲆血清溶菌酶活力和白細胞吞噬活性均無顯著影響。推測長時間飼喂甘露寡糖可能對試驗動物產生了免疫抑制。