短期飼喂兩種類型纖維對生長豬后腸菌群結(jié)構(gòu)和主要代謝產(chǎn)物的影響

張 玲，李 華，趙 瑤，陳代文，余 冰，何 軍，虞 潔，羅鈞秋，毛湘冰，鄭 萍，黃志清，羅玉衡

（四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所/教育部動物抗病營養(yǎng)重點實驗室，成都611130）

單胃動物后腸寄居著數(shù)量龐大的微生物群落，被認為是動物體內(nèi)的另一個“器官”[1]，可直接或間接參與宿主機體的營養(yǎng)代謝和免疫調(diào)節(jié)[2-3]，是影響動物健康和生長性能的重要因素之一。日糧纖維（dietary fiber，DF）是一種不能被動物體分泌的消化液所降解的復雜碳水化合物，依據(jù)其水溶性可分為可溶性日糧纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不可溶性日糧纖維（insoluble dietary fiber，IDF）。大量研究表明，DF對腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能具有明顯影響[4-5]，因此，研究不同類型/種類的DF與豬后腸微生物群落的相互關(guān)系，對生產(chǎn)上科學利用不同類型纖維源，優(yōu)化飼糧配方，降低飼料成本，及促進無抗飼糧研發(fā)具有重要意義。飼糧中添加不同類型和/或水平的可發(fā)酵碳水化合物均可影響豬腸道微生物多樣性和組成。在公豬飼糧中添加獼猴桃纖維可改變其結(jié)腸細菌群落結(jié)構(gòu)，增加結(jié)腸總細菌和擬桿菌屬（Bacteroides）細菌數(shù)量，腸桿菌屬（Enterobacteria）和大腸埃希菌（Escherichia coli）數(shù)量減少[6]。顧憲紅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1%菊粉可提高仔豬盲腸內(nèi)乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的數(shù)量。短鏈脂肪酸（SCFAs）是腸道微生物發(fā)酵碳水化合物的主要代謝產(chǎn)物，纖維來源及種類的不同，導致發(fā)酵模式的改變，進而影響代謝產(chǎn)物濃度。成年母豬采食含高水平抗性淀粉（34%）飼糧后，腸道中柔嫩梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）的相對豐度增加，Escherichia coli和假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）的相對豐度降低，且盲腸和結(jié)腸中SCFAs濃度明顯增加[8]。有限的研究集中于一種或幾種DF對豬腸道特定菌群的影響，而不同類型（尤其是可溶與不可溶性DF）與生長豬后腸微生物群落的相互關(guān)系并不清楚。因此，本研究結(jié)合變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)、實時熒光定量（Real-time PCR）和氣相色譜技術(shù)，比較短期飼喂典型SDF（燕麥β-葡聚糖）和IDF（微晶纖維素microcrystalline cellulose，MCC）后，生長豬后腸微生物群落結(jié)構(gòu)的差異、幾種特定細菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量變化，及主要代謝產(chǎn)物濃度的差異，以期為科學配制含纖維飼糧提供參考。

1 材料和方法

飼養(yǎng)試驗于2015年7—8月在四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所教學科研基地進行；PCR-DGGE、Real-time PCR和氣相色譜分析于2015年9—11月在四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所教育部動物抗病營養(yǎng)重點實驗室進行。

1.1 試驗設計及試驗動物

采用單因子試驗設計，選擇16頭體況一致、健康的（40.38±1.19）kg杜洛克×長白×大約克育肥閹公豬。預試期1 w，所有豬只飼喂基礎日糧（日糧中不含非飼糧源性DF），自由采食和飲水以適應環(huán)境。預試期結(jié)束后，單個空腹稱重，按體重無差異原則隨機分為SDF組和IDF組2個處理組，每個處理組8頭豬，正式試驗為期21 d。

1.2 纖維來源

試驗使用的燕麥β-葡聚糖購自陜西慈緣生物科技有限公司，淡黃色粉末狀，純度為70%；MCC購自曲阜市天利藥用輔料有限公司，白色粉末狀，純度≥99%。

1.3 試驗動物日糧及飼養(yǎng)管理

參照NRC 2012和中國豬飼養(yǎng)標準配制各組日糧。日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗開始前，所有試豬飼喂基礎日糧。試驗期間每天08：00，13：00和18：00定時飼喂，每次飼喂以料槽內(nèi)剩有少量飼料為宜，記錄給料量及余料量，日常觀察并記錄健康狀況。

1.4 直腸內(nèi)容物采集

在試驗第1，3，6，12，21天直腸刺激法無菌采集所有試豬新鮮糞樣，于-20℃保存，用于腸道微生物群落結(jié)構(gòu)分析；第1天和第21天另采集一份保存于-80℃，用于SCFAs濃度檢測。

1.5 指標測定

1.5.1 直腸細菌基因組DNA的提取及PCR擴增

采用試劑盒（QIAamp DNA Stool Mini Kit，德國）提取直腸內(nèi)容物宏基因組DNA作為擴增模板。以通用引物968f-GC和1401r引物擴增細菌16S rDNA V6-V8可變區(qū)[9]。PCR反應程序為：94℃5 min，94℃30 s，56℃20 s，68℃40 s，35個循環(huán)，68℃延伸7 min。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.5.2 DGGE及條帶分析

DGGE采用Bio-Rad Dcode電泳系統(tǒng)進行，變性劑濃度梯度為45%～60%。使用1×TAE緩沖液，80 V、60℃電泳12 h，硝酸銀染色，凝膠顯色定影后用CS800校正型光密度掃描分析系統(tǒng)留圖。采用Quantity one 4.6.2軟件分析DGGE圖譜，計算條帶數(shù)，進行聚類分析并計算多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）。

表1 日糧組成和營養(yǎng)水平（風干基礎）Table 1 Composition and nutrient level of experimental diets（air dry basis） %

1.5.3 SCFAs測定

使用VARIAN CP-3800氣相色譜儀（美國）測定直腸內(nèi)容物中的乙酸、丙酸、丁酸等SCFAs含量。由于上述3種酸是豬后腸主要SCFAs，故本試驗中以3種酸含量之和表示總SCFAs含量。

1.5.4 Real-time PCR擴增

H.C.庫爾納柯夫于1900年提出，在室溫以上溫度下，液態(tài)烴產(chǎn)品與其他非極性組分混合物的黏度與組分黏度之間的關(guān)系呈非線性變化，其混合油黏度可以通過組分油黏度的不同函數(shù)的線性加和來表達，如式(1)。

采用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀對直腸內(nèi)容物中的特定菌群進行定量，主要檢測菌群及引物序列見表2。反應體系（10μL）含：SYBR Premix ExTaqⅡ5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，ddH2O 3μL。反應程序參照文獻進行設定。以梯度稀釋后的各純化PCR產(chǎn)物為模板建立標準曲線并計算拷貝數(shù)。

表2 用于定量檢測的特定菌群的引物序列Table 2 The specific primers for certain microbial groups using in the real-time PCR analysis

表3 不同DF對生長豬生產(chǎn)性能的影響Table 3 Effect of two types of DF on the performance of growing pigs

1.6 數(shù)據(jù)分析

不同時間點直腸內(nèi)容物細菌Shannon指數(shù)的差異采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，并進行Duncan氏多重比較，其余數(shù)據(jù)進行t檢驗分析，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，0.05＜P＜0.1表示差異具有顯著趨勢。結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種日糧纖維對生長豬生產(chǎn)性能的影響

由表3可知，SDF組和IDF組試豬末重，ADG和ADFI差異均不顯著（P＞0.05）；與IDF組相比，SDF組豬只料重比有降低趨勢（0.05＜P＜0.1）。

2.2 兩種DF對生長豬后腸細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

DGGE圖譜的UPGAMA聚類分析結(jié)果顯示，SDF組第1天和第21天樣品被明顯區(qū)分為兩簇：第1天6個樣品聚于一簇，相似性為0.53，第21天6個樣品聚于一簇，相似性為0.51（圖1，A）；IDF組第1天和第21天樣品被明顯分為兩簇：第1天8個樣品聚于一簇，相似性為0.51，第21天7個樣品聚于一簇，相似性為0.55（圖1，B）。

通過比較同一處理不同時間點Shannon指數(shù)（表4），發(fā)現(xiàn)兩個處理組樣品均在不同時間點表現(xiàn)出明顯差異，SDF組為第3、6、12天樣品的Shannon指數(shù)顯著低于第1和21天（P＜0.01），第21天樣品的Shannon指數(shù)顯著低于第1天；IDF組則是第1天樣品的Shannon指數(shù)顯著低于其余各采樣時間點。

圖1 PCR-DGGE圖譜聚類分析Figure 1 Cluster analysis of PCR-DGGE profile

表4 不同時間點兩處理豬直腸細菌群落多樣性指數(shù)Table 4 The bacterial Shannon index in the rectal samples of pigs in the two different groups collected at different

2.3 兩種DF對生長豬直腸特定菌群數(shù)量的影響

由表5可知，試驗末期，SDF組豬只直腸內(nèi)容物中總細菌數(shù)量極顯著降低（P＜0.01）；Firmicutes和Lactobacillus數(shù)量顯著降低（P＜0.05）；Escherichia coli數(shù)量極顯著增加（P＜0.01）；SRB和Bifidobacterium數(shù)量略微上升（0.05＜P＜0.1）；產(chǎn)甲烷菌數(shù)量有降低趨勢（0.05＜P＜0.1）。Firmicutes、Prevotella和Escherichia coli是IDF組變化最大的細菌，試驗結(jié)束時，F(xiàn)irmicutes數(shù)量極顯著降低（P＜0.01），Prevotella和Escherichia coli數(shù)量顯著升高（P＜0.05）。

2.4 兩種DF對生長豬直腸內(nèi)容物SCFAs含量的影響

由表6可知，試驗末期SDF組試豬直腸內(nèi)容物中乙酸含量較試驗初顯著降低（P＜0.05），丙酸和總SCFAs含量呈下降趨勢（0.05＜P＜0.1）；乙酸、丙酸、丁酸比例在試驗初、末差異不顯著（P＞0.05）。試驗末期IDF組試豬直腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸含量及乙丙比較試驗初期顯著降低（P＜0.05），總SCFAs含量較試驗初期極顯著降低（P＜0.01），其中乙酸相對濃度顯著高于試驗初期（P＜0.05），丙酸和丁酸比例較試驗初期略有上升（0.05＜P＜0.1）。

表5 不同采樣時間點兩處理豬直腸特定菌群數(shù)量[log10（拷貝數(shù)）/g干重]Table 5 The quantity of certain bacterial groups in the rectal samples of pigs in the two different groups collected at different time points[log10（copy numbers of gene）/gram of dry weight]

表6 試驗初、末兩處理組豬直腸內(nèi)容物中SCFAs含量Table 6 The concentrate of SCFAs in the rectal samples of pigs in the two different groups at the beginning and end of the experiment

3 討論

兩種DF對試豬直腸微生物群落結(jié)構(gòu)的影響截然不同。飼喂含SDF飼糧后，試豬直腸微生物多樣性降低，而飼喂含IDF飼糧后，試豬直腸微生物多樣性則升高，且DGGE圖譜的聚類分析結(jié)果表明采食含兩種DF的飼糧后，兩組豬后腸菌群均發(fā)生了明顯變化（試驗開始和結(jié)束時直腸菌群分別聚于兩簇），暗示豬后腸細菌群落對SDF和IDF兩種DF的響應可能完全不同。

就考察的特定微生物的組成而言，兩種不同DF對生長豬后腸菌群數(shù)量的影響也表現(xiàn)出明顯差異。Firmicutes是動物機體主要細菌門類之一，盡管其數(shù)量在兩個處理組均呈現(xiàn)為降低，但IDF組降低幅度更大（SDF組降幅為4.6%，IDF組為23%），可能與該門細菌更偏好植物性多糖和低聚糖有關(guān)[23]，而MCC屬于人工合成純纖維素，F(xiàn)irmicutes對底物的選擇性使其對MCC的利用程度較低。Prevotella是一類被證明可以利用纖維素和木聚糖的菌屬[24]，在人類的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，攝入植物性多糖時，該菌是腸道中的優(yōu)勢菌屬[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)飼喂含外源DF的飼糧后，兩處理組豬直腸內(nèi)容物中該菌屬數(shù)量均增加，但IDF組增加幅度更大，說明該菌不僅可利用天然纖維素，可能對可溶性植物纖維和合成純纖維素也有一定降解能力，暗示其生長底物的廣泛性。我們對常見的Bifidobacterium和Lactobacillus兩種益生菌以及常見致病菌（Escherichia coli）也進行了考察。前人研究表明單獨添加瓜爾膠（一種典型SDF）可促進Lactobacillus的生長，而添加纖維素刺激Bifidobacterium生長[27]，但本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加SDF后，生長豬后腸兩種益生菌的數(shù)量均表現(xiàn)為降低，且采食含兩種DF的飼糧后，豬直腸Escherichia coli數(shù)量均增加。造成這種變化的原因可能如下：①本研究中添加的SDF是燕麥β-葡聚糖，黏度較高，食糜在腸腔中停留時間較長有利于腸桿菌的生長[28]；②MCC具有吸水膨脹的特性，提高腸道排空速率，其獨特的“清掃”機制[29]可從腸腔帶走大量微生物；③直腸是單胃動物的末端腸道，腸腔pH環(huán)境偏中性不利于喜酸性的益生菌生長[30]，但兩種DF的添加是否影響腸腔pH未知。該結(jié)果同時暗示并非所有的DF都對動物腸道健康有利，配制含纖維飼糧時應綜合考慮DF的類型、來源和添加量。

SRB和產(chǎn)甲烷菌是單胃動物后腸的兩大類耗氫微生物[31]，可通過移除發(fā)酵體系的氫來提高后腸微生物的發(fā)酵效率。飼喂含β-葡聚糖飼糧后，試豬后腸SRB數(shù)量增加，而產(chǎn)甲烷菌數(shù)量略微降低，說明在發(fā)酵β-葡聚糖的過程中，兩種菌之間可能存在競爭關(guān)系。而飼喂含MCC飼糧后并未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，暗示SRB和產(chǎn)甲烷菌對飼糧中IDF的響應可能并不敏感。

SCFAs是微生物主要代謝產(chǎn)物，在微生物與宿主營養(yǎng)及免疫關(guān)系中扮演重要角色[32-33]。本研究中短期飼喂含兩種DF的飼糧后，生長豬后腸SCFAs濃度均降低，但相對IDF組而言，SDF組乙酸、丙酸、丁酸和總SCFAs含量均較高。前人研究也發(fā)現(xiàn)飼糧中添加3%菊粉降低仔豬后腸中總SCFAs含量[34]，尤其是乙酸含量，但具體原因有待探明。IDF組各SCFAs含量降低的同時，乙酸、丙酸和丁酸的相對比例也發(fā)生改變，表現(xiàn)為乙酸比例升高，丙酸和丁酸比例降低。說明豬后腸微生物對SDF和IDF具有明顯不同的發(fā)酵模式。我們前期研究發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)存在利用燕麥β-葡聚糖和MCC的核心菌群[35-36]，很可能由于核心菌群對底物的選擇性利用造成了兩種DF后腸發(fā)酵模式的不同。

4 結(jié)論

①短期（21 d）攝入含SDF（以燕麥β-葡聚糖為代表）和IDF（以MCC為代表）飼糧后，生長豬生長性能不受影響，但含SDF飼糧可降低采食量和料重比。

②飼糧中短期添加SDF（純度≥70%）降低生長豬后腸細菌多樣性，添加IDF（純度≥99%）則傾向于提高生長豬后腸細菌多樣性。

③與試驗開始時相比，采食含SDF飼糧21 d后，生長豬后腸總細菌、Firmicutes和Lactobacillus數(shù)量降低；采食含IDF飼糧后，豬后腸中Prevotella數(shù)量升高。本試驗條件下，攝入含SDF或IDF飼糧均不利于后腸益生菌Bifidobacterium和Lactobacillus的生長，但兩種DF造成豬后腸Escherichia coli數(shù)量增加的機制可能不同。

④與試驗開始時相比，采食含SDF飼糧21 d后，生長豬后腸SCFAs（尤其是乙酸）濃度降低；而采食含IDF飼糧后，豬后腸乙酸、丙酸、丁酸和總SCFAs濃度均降低，說明豬后腸微生物對IDF和SDF的發(fā)酵模式明顯不同。

⑤不同類型或來源的DF可能通過與后腸微生物的互作，影響豬腸道內(nèi)環(huán)境和腸道健康，最終可能影響宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率。生產(chǎn)上配制飼糧配方時，應將DF對腸道微生物的影響納入考慮范圍。