甜櫻桃GalDH、GalLDH的克隆及在果實發育過程的表達

黃曉婧，趙雪雯，呂秀蘭，梁 東*

（1.四川農業大學園藝學院，成都611130；2.四川農業大學果蔬研究所，成都611130）

抗壞血酸（ascorbicacid，AsA）又稱維生素C（vitamin C），是一種水溶性抗氧化有機小分子[1]，在植物中不僅是重要的抗氧化劑和輔酶因子[2]，而且還影響植物碳氮代謝[3]、非生物逆境抗性[4]、細胞生長[5-6]，參與激素合成[7]與信號轉導過程中相關基因的表達調控[8]。AsA與人類健康密切相關[9]，但是人體自身不能合成，必須從食物中獲取，因此研究植物中AsA的形成及調控機制，改良植物組織中的AsA的含量對植物的自身生長發育、抗逆生長以及對人類健康都具有重要的意義。

高等植物合成AsA有4條途徑，目前公認的大多數植物體內AsA合成的主要途徑是L-半乳糖途徑[10-11]。L-半乳糖-1，4-內酯脫氫酶（L-galactono-1，4-lactone dehydrogenase，GalLDH）與L-半乳糖脫氫酶（L-galactose dehydrogenase，GalDH）是該途徑中的最后2個脫氫酶。GalDH催化L-半乳糖脫氫生成L-半乳糖-1，4-內酯，再經GalLDH進一步脫氫合成AsA。AsA合成機制的研究過去主要集中于擬南芥、煙草等模式植物，對多年生木本植物果實中形成機制的研究很少，尤其是具有“早春第一果”之稱的甜櫻桃。甜櫻桃（Prunus aviumL.）屬薔薇科李亞科李屬櫻亞屬（Subgenus cerasus），是人類獲取Vc的重要果品資源。本研究以甜櫻桃“佐藤錦“為材料，克隆AsA生物合成關鍵酶基因GalDH和GalLDH，并分析其在果實生長發育過程中的表達變化，為進一步深入研究甜櫻桃抗壞血酸合成分子機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

甜櫻桃“佐藤錦”果實采于四川省雅安市漢源縣九襄鎮甜櫻桃示范園，樹齡5～7年生，管理條件一致。全樹70%以上花瓣脫落視為第0天，于花后第0、10、20、30、40、50天進行定株均勻采樣，以單株作為實驗單元，3次重復。每次取樣后，迅速在冰上切成小塊，在液氮中速凍，最后存放在-80℃超低溫冰箱備用。

1.2 總RNA的提取

甜櫻桃總RNA的提取采用改良CTAB-LiCI法[12]。取1μL總RNA在1%瓊脂凝膠上電泳檢測RNA質量，通過核酸蛋白測定儀測定其在280、260、230 nm處吸光度以確定濃度、純度后于-80℃保存備用。

1.3 基因的克隆

以總RNA作為模板，按照TaKaRa公司反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，合成cDNA第一鏈。根據在NCBI上查找到的同源性較高的甜櫻桃或桃的GalDH和GalLDH基因，利用Primer 5.0軟件設計特異引物(見表1)，以甜櫻桃cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系：模板2μL、10μm的正義引物與反義引 物各1μL、buffer 2.5μL、MgCl22μL、dNTP 2μL、Taq酶0.5μL、ddH2O 14μL。PCR反應程序為：94℃5 min；94℃45 s，退火56℃或54℃1 min，72℃90 s，35個循環；72℃10 min，4℃保持。其產物用1%的瓊脂凝膠電泳檢測，用膠純化回收試劑盒回收目的片段，連接克隆載體pMD19-T，轉化大腸桿菌感受態DH5a，經氨芐青霉素（Amp）抗性篩選后，挑取白色單菌落，搖菌后進行菌液PCR鑒定，并選取陽性克隆送至成都擎科生物公司測序。

1.4 序列分析

根據測序得到的PacGalDH和PacGalLDH基因的cDNA全長序列，利用DNAstar EditSeq查找開放閱讀框；利用DNAMAN軟件推導相應的氨基酸序列以及分析與其他植物GalDH和GalLDH基因編碼的氨基酸序列的同源性；序列比對用Bioedit 5，Protparam軟件分析蛋白理化性質；隨后用MEGA5和ClustalX 2軟件鄰接法構建系統進化樹。

1.5 基因表達分析

通過實時熒光定量法測定GalDH和GalLDH在甜櫻桃果實各個長期的表達水平。據cDNA測序結果，設計定量表達引物PacGalDH、PacGalLDH、內參基因Actin和EF（見表1）。然后按照SYBR Premix ExTaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明進行擴增，擴增體系：SYBR Green qPCR SuperMix 10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，cDNA模板1.5μL，ddH2O 6.9μL。反應程序：95℃10 min，95℃10 s，60℃，31 s，72℃20 s，溶解曲線反應，共40個循環，每樣品設置3個重復。反應結束后觀察熒光值變化曲線和熔解曲線，利用2-ΔΔCt法[13]分析結果。

表1 基因克隆及表達引物Table 1 Primers used for gene cloning and expression in this study

1.6 甜櫻桃果實中T-AsA含量的測定

稱取果實樣品約0.5 g，用5 mL 0.2%偏磷酸水溶液研磨充分（冰上研磨且避光），倒入10 mL離心管，4℃條件下8 000 r/min離心10 min，用0.22μm的濾頭過濾后可上機檢測；液相條件：流速0.5 mL/min，進樣量10μL，波長243 nm，柱溫箱溫度25℃；流動相為甲醇∶水=15∶85。

1.7 數據分析

使用Microsoft Excel 2010計算試驗所得數據，采用SPSS20.0進行顯著性分析，使用SigmaPlot 12.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 PacGalDH和PacGalLDH基因的克隆與序列分析

以甜櫻桃佐藤錦果實總RNA反轉錄得到cDNA作為模板，以表1中的引物進行PCR擴增，回收純化目的片段并與pMD19-T載體相連，經PCR鑒定后，對陽性克隆進行測序。測序結果顯示：PacGalDH基因的cDNA全長為1 253 bp，含有975 bp完整的開放閱讀框，編碼324個氨基酸（見圖1A），GenBank登錄號為KX196291。利用Protparam軟件分析，其編碼的蛋白質相對分子量為34.89 kD，理論等電點值為5.79，帶正電荷殘基總數35，帶負電荷殘基總數為38，總平均親水性（GRAVY）為-0.009。PacGalLDH基因的cDNA全長為1 914 bp，含有1 791 bp完整的開放閱讀框，編碼596個氨基酸（見圖1 B），GenBank登錄號為KX196292。其編碼的蛋白質相對分子量為67.47 kD，理論等電點值為8.47，帶正電荷殘基總數82，帶負電荷殘基總數為77，總平均親水性（GRAVY）為-0.445。

2.2 PacGalDH和PacGalLDH基因序列的同源性分析

在NCBI上搜索PacGalDH與PacGalLDH基因編碼氨基酸的同源序列，發現PacGalDH和PacGalLDH基因編碼的氨基酸序列與其他植物的抗壞血酸合成相關基因編碼的氨基酸具有極高的同源性，其中與梅（Prunus mume）、桃（Prunus persica）、蘋果（Malus x domestica）、梨（Pyrus x bretschneideri）、棗（Ziziphus jujuba）、葡萄（Vitis vinifera）等植物的GalDH和GalLDH編碼的氨基酸序列同源性均在95%以上。其中PacGalDH基因與桃（BAH03302.1）的相似性達到98%，PacGalLDH基因與梅（XP_008236174.1）的相似性達到98%。

為了確定PacGalDH與PacGalLDH與其他植物的同緣關系，利用MEGA 5.10軟件與ClustalX2軟件鄰接法構建系統進化樹（見圖2）。通過圖2A可以看出，PacGalDH與桃（BAH03302.1）和梅（XP_008236174.1）的分支較近，同源性高達96%，其次是蘋果（AAP21783.1）和梨（XP_009346449.1），與柑橘（XP_006486798.1）的分支最遠；PacGalLDH與桃（BAH03303.1）的分支最近，同源性高達100%，其次是梅（XP_008240731.1）、蘋果（NP_001315785.1）和梨（XP_009349063.1），與軟棗獼猴桃（AKA45052.1）的分支最遠。

2.3 佐藤錦果實發育過程中T-AsA含量變化及PacGalDH和PacGalLDH的表達模式分析

利用HPLC測定佐藤錦果實發育過程中TAsA含量變化，如圖3A，在花后0 d，果實中T-AsA含量最高，達44.7 ng/g。在花后0～10 d急劇下降，在第40 d達到最低值，隨后在果實完全成熟之前TAsA含量雖有上升但不顯著。

圖1 甜櫻桃GalDH(A)和GalLDH基因(B)的cDNA序列及推導的氨基酸序列Figure 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PacGalDH(A)and PacGalLDH(B)

通過qRT-PCR技術檢測了PacGalDH、PacGalLDH在佐藤錦果實發育過程的表達水平，結果顯示：花后10 d，PacGalDH的表達量顯著上升，達到峰值；隨后其表達量呈下降趨勢。PacGalLDH的表達量在0～10 d緩慢上升，之后10～50 d呈下降趨勢，在花后50 d的表達量低于花后0 d的表達量。從整體來看，PacGalDH在果實中的表達量要高于PacGalLDH（見圖3B）。

3 討論與結論

生物合成是植物細胞AsA積累的主要原因[11，14]。大量研究證實L-半乳糖途徑是高等植物AsA生物合成的主要途徑，如蘋果[15]、獼猴桃[16]、西印度櫻桃[17]、桃[18]、黑加侖[19]，有的植物如擬南芥[20]甚至將L-半乳糖途徑作為唯一的AsA合成途徑，對AsA生物合成代謝調控的研究多集中在這一途徑[21]。有研究認為GalDH是L-半乳糖生物合成途徑的重要依據，并且還是植物自身能否合成AsA的前提[22]。目前，關于甜櫻桃GalDH和GalLDH的研究鮮有報道。本研究通過對佐藤錦甜櫻桃果實AsA L-半乳糖合成途徑相關基因GalDH和GalLDH的克隆與表達的研究發現，這2個基因在果實生長發育周期均有表達，并且表達量變化趨勢與果實T-AsA積累水平有較高的相似性，這表明甜櫻桃果實AsA生物合成存在L-半乳糖途徑，并且該途徑很可能是甜櫻桃AsA合成累積的主要途徑。

圖2 GalDH(A)和GalLDH基因(B)推導的氨基酸與其他植物的系統發育樹Figure 2 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of GalDH(A)and GalLDH(B)gene

圖3 甜櫻桃果實T-AsA含量(A)及GalDH和GalLDH基因的表達量變化(B)Figure 3 Changes of T-AsA concentration as well as GalDH and GalLDH expression levels in the sweet cherry fruit

關于AsA生物合成的一些關鍵酶活性和一些基因的表達共同調節果實中AsA含量變化已有一些研究[23-26]。在Jiang Z.Y.等[27]的研究中，GalDH的活性與其對應基因的表達與獼猴桃果實采后AsA含量顯著正相關，雖然GalLDH也有較高活性，但是其表達在采后期間基本沒變化。這一結果與鐘雨[28]的研究結果一致。高靜等[29]對“皇家嘎啦”蘋果的研究表明GalDH是幼果期蘋果果實L-半乳糖途徑中的關鍵限速酶。在本研究中，PacGalDH與PacGalLDH的表達量變化趨勢在整體上與T-AsA水平變化基本一致，但是PacGalDH在果實生長發育期間的表達量要顯著高于PacGalLDH，進一步說明GalDH基因與甜櫻桃AsA的積累顯著相關，GalDH可能控制甜櫻桃AsA生物合成。