苗床添加木霉菌肥對2種煙苗生長及抗逆酶活性的影響

曾慶賓，李 濤，茍小梅，余 偉，張宇羽，3，楊軍偉，蔡 艷*，官 宇，閆芳芳

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都611130；2.四川省煙草公司攀枝花市公司，四川攀枝花617026；3.四川省綿竹市農(nóng)業(yè)局，四川 德陽618200）

木霉菌（Trichoderma）是一種普遍存在的生防性真菌[1]，屬于半知菌類絲孢綱叢梗孢目叢梗孢科[2]，它具有廣譜性、生長繁殖速度快、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[3-4]，在防治植物病害方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值，已成為國際上最有學(xué)術(shù)和應(yīng)用價(jià)值的資源微生物之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌生防機(jī)制主要包括競爭、寄生、溶菌以及抗生等微生物間的拮抗作用[6]，卻忽視了寄主植物本身的參與[7]，而木霉菌誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗病性較單一的生物拮抗機(jī)制更為重要，是對植物免疫能力的全面提升。除此之外，木霉菌還具有促進(jìn)植物生長（提高土壤營養(yǎng)有效性和植物營養(yǎng)利用率）的作用[8]，主要表現(xiàn)在刺激種子萌發(fā)、根的伸長和開花結(jié)實(shí)[9]；此外，木霉菌肥能提高玉米的出苗率、根長、株高、鮮重和干重，對玉米生長具有促進(jìn)作用[10]；木霉菌肥還能明顯促進(jìn)甜瓜、棉花等作物的生長[11-12]。

木霉菌肥在烤煙上應(yīng)用已有大量研究，王革、陳志敏、陳小均等[13-15]研究發(fā)現(xiàn)木霉菌肥對烤煙黑脛病菌、疫霉菌、鐮刀菌等具有拮抗作用，并對烤煙有一定的促生作用。烤煙一般適宜在pH值5.5～6.5的微酸性土壤中生長，但由于烤煙生產(chǎn)中長期大量施用硫酸鉀和硝酸鉀導(dǎo)致土壤pH值降低[16-17]，過低的pH值導(dǎo)致微生物活性受到抑制，土壤中直接施入木霉菌肥，無法得到良好的使用效果[18]。較土壤而言，育苗基質(zhì)本身的環(huán)境較穩(wěn)定且易于控制，有利于木霉菌肥發(fā)揮其作用。因此本文采用苗床添加木霉菌肥的方法，探究其對2種烤煙品種相關(guān)抗逆酶活性以及煙苗素質(zhì)的影響，以期為木霉菌肥在烤煙上的應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試植物：紅花大金元（Honghuadajinyuan，抗性較弱）和云煙85（Yunyan85，抗性較強(qiáng)），其種子均由云南玉溪中煙種子有限公司提供。紅花大金元對煙草常見病害抗性較弱，易感黑脛病、青枯病，中感野火病和煙草花葉病；云煙85具有優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，高抗黑脛病、青枯病，對煙草花葉病、根結(jié)線蟲病抗性也較強(qiáng)[19]。

供試菌肥：木霉菌肥，由愛睦樂環(huán)保生物技術(shù)（南京）有限公司提供，每克菌肥含活菌數(shù)大于2億，其全氮、全磷、全鉀含量分別為0.08%、0.15%、0.22%。

供試土壤：水稻土，基本理化性質(zhì)為：pH 5.95，有機(jī)質(zhì)31.18 g/kg，全氮1.54 g/kg，全磷0.93 g/kg，全鉀13.94 g/kg，堿解氮115 g/kg，有效磷24.08 g/kg，速效鉀290.80 g/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

采用濕潤育苗方法，在四川省攀枝花市米易縣普威鎮(zhèn)烤煙育苗大棚中進(jìn)行育苗試驗(yàn)。育苗大棚內(nèi)設(shè)有溫度計(jì)和濕度計(jì)，調(diào)控溫濕度在煙苗生長適宜范圍內(nèi)。依據(jù)木霉菌肥不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（菌肥/基質(zhì)質(zhì)量），2種烤煙各設(shè)4個處理：①T0（不施菌肥）；②T1（添加5%菌肥）；③T2（添加10%菌肥）；④T3（添加15%菌肥）。將菌肥與基質(zhì)混勻后播種，每個苗盤裝基質(zhì)0.60 kg。苗盤含100穴，每穴1～2棵烤煙包衣種子，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。其他管理同常規(guī)。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 植株農(nóng)藝性狀測定

菌肥處理70 d（移栽前），從2種烤煙的每個處理各選取10株煙苗，測量其株高、莖圍、最大葉長以及最大葉寬，并計(jì)算最大葉面積。

1.3.2 植株N、P、K含量測定

菌肥處理70 d（移栽前），從苗盤中隨機(jī)選取30株煙苗，連同基質(zhì)一起輕輕拔出，用自來水仔細(xì)沖洗根系和地上部，去除育苗基質(zhì)及其他表面雜物，用去離子水洗凈，吸水紙吸干水分，將根系與地上部分分開。隨機(jī)選取10株于105℃殺青30 min，75℃下烘至恒重，分地上部分和地下部分分別稱量。將烘干的根系和地上部分磨碎，過0.425 mm×0.425 mm篩子，濃H2SO4-H2O2消煮，凱式定氮法測定N含量，釩鉬黃比色法測定P含量，火焰光度法測定K含量[20]。

1.3.3 抗逆酶活性測定

菌肥處理70 d（移栽前），根和葉分別取0.50 g鮮質(zhì)量樣品于液氮中研磨成粉末，分別采用愈創(chuàng)木酚法、紫外分光光度計(jì)法、抗壞血酸消耗量法測定煙葉和烤煙根系中過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2013整理與繪圖，采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析和顯著性分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用"平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤"表示，采用最小顯著差法（LSD）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌肥對2種煙苗生長的影響

由表1可知，除T1和T2處理的株高外，3個濃度的木霉菌肥均能顯著提高2種烤煙幼苗株高、莖圍、最大葉長、最大葉寬和最大葉面積。高濃度（T3處理）木霉菌肥對2種幼苗株高和莖圍的促生作用最強(qiáng)，相比T0分別提高50.2%、33.9%和16.0%、16.7%；中低濃度（T1、T2處理）木霉菌肥對2種幼苗最大葉長的促生作用不及T3處理，T3處理葉片長度分別比T0高53.2%、16.9%，且與T0比差異顯著；此外高濃度處理對紅花大金元幼苗最大葉寬和最大葉面積提升顯著，分別高出對照46.2%、123.0%；而云煙85的最大葉寬以T2處理最優(yōu)，最大葉面積以T1處理最高。因此相比其他處理，高濃度T3處理對2種烤煙幼苗促生效果最佳。

表1 木霉菌肥對2種煙苗生長的影響Table 1 Effects of Trichoderma fertilizer on the agronomic characters of two tobacco seedlings

2.2 木霉菌肥對2種煙苗N、P、K積累量的影響

由表2分析可知，添加木霉菌肥后，紅花大金元幼苗地上部分和地下部分N積累量均隨著菌肥濃度的增加而呈現(xiàn)顯著上升的趨勢。其中以T3處理增加最多，地上部分和地下部分N積累量分別較T0提高93.0%和44.6%。隨著木霉菌肥濃度的增加，紅花大金元幼苗地上部分P積累量先降低后升高，而其地下部分各處理P積累量較T0均有顯著提高，分別提高了17.9%、16.5%、37.8%。除T1處理地上部分外，其余處理地上地下部分紅花大金元幼苗K積累量均顯著高于T0處理。添加木霉菌菌肥后，除T1處理的地下部分K積累量外，云煙85幼苗的N、P、K積累量均顯著高于T0處理，其中以T2、T3處理效果較好。

2.3 木霉菌肥對2種煙苗相關(guān)抗逆酶活性的影響

2.3.1 過氧化氫酶（CAT）

過氧化氫酶（CAT）普遍存在于植物組織中，其活性與植物的代謝強(qiáng)度及抗寒、抗病能力呈顯著正相關(guān)關(guān)系[22]。由圖1分析可知，苗床添加木霉菌肥均能不同程度提高2種煙苗CAT活性。就根部分而言，紅花大金元CAT活性T2（1.44 U/mg）、T3（0.98 U/mg）處理較T0（0.50 U/mg）顯著提高，其中T2處理較T0增加188.0%。云煙85 CAT活性以T1（1.70 U/mg）、T2（1.52 U/mg）處理提升效果顯著，相比T0（0.86 U/mg）提高了97.7%和76.7%，而T3處理提升效果不顯著。從葉部分來看，紅花大金元CAT活性以T2（1.61 U/mg）處理效果最佳，較T0（1.28 U/mg）提高了25.8%。云煙85的CAT活性則隨著木霉菌肥濃度的增加而呈持續(xù)升高的趨勢，其中T2（1.45 U/mg）和T3（1.82 U/mg）提升效果顯著，分別較T0（1.07 U/mg）增加36.4%和70.1%，由此可見，苗床添加木霉菌肥可顯著提升2種煙苗CAT活性，其中添加10%菌肥的處理效果最明顯，紅花大金元提升效果優(yōu)于云煙85，煙草根系比葉片更敏感。

2.3.2 過氧化物酶（POD）

過氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)普遍存在且活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有密切關(guān)系[22]。由圖2可知，苗床添加中高濃度木霉菌肥可不同程度提高2種煙草幼苗根系POD活性，T3處理（3 563.9 U/mg、4 597.6 U/mg）分別較T0（3 143.9 U/mg、2 856.6 U/mg）處理顯著增加13.3%和60.9%。從葉部分看，紅花大金元T1（654.1 U/mg）、T2（668.2 U/mg）處理較T0（1 007.6 U/mg）POD活性分別降低35.1%和33.7%，但T3（1 208.9 U/mg）處理相比對照提高20.0%。此外，云煙85的POD活性雖隨木霉菌肥濃度的增加先升高后降低，但均未達(dá)顯著水平，說明木霉菌肥對云煙85葉POD活性無明顯影響。綜上所述，苗床添加中高濃度木霉菌肥可提高紅花大金元和云煙85根系POD活性，高濃度木霉菌肥還可提高紅花大金元葉POD活性。

表2 木霉菌肥對2種煙苗N、P、K積累量的影響Table 2 Effects of Trichoderma fertilizer on the N、P、K content of two tobacco seedlings

3 討論與結(jié)論

由于木霉菌與植物根系相互作用的途徑和生長素介導(dǎo)的信號傳遞途徑相似，因此二者互作可以促進(jìn)植物生長[23]，同時木霉菌劑的某些編碼可以抑制植物激素乙烯合成，其含量減少同樣可以促進(jìn)植物生長[24]。本研究中，苗床添加木霉菌肥可以顯著提高紅花大金元和云煙85的株高、莖圍、葉長葉寬等相關(guān)農(nóng)藝性狀指標(biāo)；同時，喻會平、端永明、王革等[25-27]發(fā)現(xiàn)無論是使用木霉菌劑浸種或者噴施、直接施用木霉菌劑均能有效提高煙苗素質(zhì)，為大田移栽提供可靠保障，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

近年來一些機(jī)構(gòu)研究篩選出具有解磷解鉀作用的木霉菌株，改菌株在應(yīng)用時具有提高化肥利用率、大幅度降解農(nóng)藥、吸附重金屬以及提高作物產(chǎn)量等作用[8]。本研究結(jié)果表明，育苗基質(zhì)添加木霉菌肥可明顯提高烤煙幼苗對N、P、K的吸收積累量，且隨著濃度的增加呈持續(xù)上升的趨勢，這是由于木霉菌肥提高了化肥和土壤養(yǎng)分的利用率[28]。王革等[27]認(rèn)為烤煙施用木霉菌肥后，煙株的干物重、養(yǎng)分吸收量、肥料與土壤養(yǎng)分利用率均能不同程度提高，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

圖1 木霉菌肥對2種煙苗過氧化氫酶活性的影響Figure 1 Effects of Trichoderma fertilizer on CAT activity of two tobacco seedlings

圖2 木霉菌肥對2種煙苗過氧化物酶活性的影響Figure 2 Effects of Trichoderma fertilizer on POD activity of two tobacco seedlings

木霉菌生防作用機(jī)制主要包括：代謝多種胞外酶水解植物病原真菌細(xì)胞壁；代謝產(chǎn)生木霉菌素、綠木霉素、萜類、辛酮、氨基酸衍生物等抗生素類物質(zhì)；產(chǎn)生植物防御反應(yīng)的誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)植物抗性；以多種協(xié)同拮抗作用，抑制病原菌的生長與繁殖；增強(qiáng)植物組織的多種抗逆酶活性[29]。關(guān)于增強(qiáng)植物抗逆酶活性方面，莊敬華、黃艷青等[30-31]的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)木霉菌處理后黃瓜、甜瓜幼苗根系幾種防御酶活性均有所上升，并且黃瓜和甜瓜幼苗枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)在一定程度上控制得到。烤煙是依靠收獲葉片而獲得經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物，在其生長發(fā)育過程中易受到真菌、細(xì)菌性等多種有害生物危害[32]。而過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）則是生物演化過程中建立起來的生防生化系統(tǒng)關(guān)鍵酶，它們能使植物體內(nèi)的活性氧及過氧化氫等物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚暂^低的物質(zhì)，降低或消除它們對作物膜脂的攻擊能力，使膜脂不被氧化而得到保護(hù)。抗逆酶活性的大小是表征植株抗逆性強(qiáng)弱的主要參數(shù)，因此可以反映菌劑添加后誘導(dǎo)煙苗抗性的作用效果[29，33]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，木霉菌肥可以有效提高紅花大金元和云煙85煙苗根系和葉片的CAT和POD活性，增強(qiáng)其對煙草病害的抗性，尤其是對易感病的紅花大金元品種的抗性強(qiáng)化作用更加明顯，10%添加量時其根系CAT活性較對照增加188.0%，而云煙85僅增加了76.7%。本試驗(yàn)還表明，2種煙草根系抗逆酶活性增加率普遍高于葉片，說明木霉菌肥可能對增強(qiáng)2種煙草抵抗土傳病害（如黑脛病、青枯病）的作用效果優(yōu)于空氣傳播病害（如花葉病）。

苗床添加木霉菌肥對紅花大金元和云煙85幼苗的生長和養(yǎng)分吸收均表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，其株高、莖圍、最大葉面積等生長指標(biāo)和N、P、K積累量均顯著增加，中高濃度添加量煙苗促生效果和養(yǎng)分吸收增加量更明顯。此外，苗床添加木霉菌肥均能不同程度提高2種煙苗根和葉的過氧化氫酶、過氧化物酶活性，紅花大金元提升作用強(qiáng)于云煙85，根系增加幅度高于葉片，過氧化氫酶和過氧化物酶活性分別在10%和15%濃度達(dá)到最高或次高值。