鎘脅迫對東營野生大豆幼苗抗氧化系統及可溶性蛋白的影響

尚玉坤，劉思凱，陳楊晗，劉 鱺，唐學博，秦宗志，廖進秋

（四川農業大學生命科學學院，四川 雅安625014）

2014年四川省環保廳和國土廳聯合發布《四川省土壤污染狀況調查公報》[1]中指出四川省由于工業的快速發展以及農業中化肥的不合理使用，土壤環境污染狀況形勢嚴峻，攀西地區、成都平原區和川南地區等部分地區土壤重金屬污染問題較突出，其中Cd是主要污染物。土壤中的Cd主要來自成土母質，含量范圍一般為0.01～2 mg/kg[2]。土壤中Cd含量增加，嚴重威脅人們的食品安全。Cd污染地區種植水稻和小麥等農產品的Cd含量容易超標[3-4]。當Cd2+在植物體內富集到一定程度時，會影響植物體的生長，從而使植物表現出植株矮小、生長遲緩、產量下降等癥狀[5-7]。相關研究表明：小麥籽粒、花生幼苗和大豆中Cd含量與土壤中Cd含量呈正相關[8-9]。而大豆不同部位對Cd的吸收能力存在差異，表現為根＞莖＞葉＞籽粒[10]。

四川省栽培大豆缺乏優良種質資源，加上無選擇性的引種，經常會因為不適宜本地區的土壤和環境特征而減產，甚至絕收，給大豆相關產業造成重大經濟損失[11-12]。野生大豆是大豆種質資源庫中很重要的組成部分，是栽培大豆的近緣祖先種，常見的栽培大豆有些性狀不能滿足人們的需求，如抗逆性差。而野生大豆在長期的自然選擇過程中形成了較為豐富的變異類型，如攜帶抗病蟲害、抗旱、抗寒、耐鹽堿、結莢多而密等有利基因，是栽培大豆遺傳育種的重要資源，也是大豆起源、演化、生態、分類、生理等研究不可多得的育種材料，可以通過野生大豆資源進行栽培品種的遺傳改良[13]。

高等植物可以耐受一定濃度的Cd脅迫，通過酶促系統降低重金屬對植物細胞的損害。例如：低濃度Cd脅迫條件下，玉米幼苗可通過本身的調節機制，增強抗氧化酶活性，從而促進玉米幼苗生長，而高濃度則表現為抑制作用[14]。另外，棉花可以忍受Cd的長期毒害而不會大幅度減產，這意味著棉花具有較強的耐鎘脅迫能力[15]。小麥幼苗在Cd脅迫條件下，SOD、CAT均失去活性而POD活性隨處理濃度增加而增加，表明POD積極參與了脅迫條件下活性氧的清除[16]。在逆境下還可以通過可溶性蛋白滲透調節適應環境的改變，增強細胞的保水能力，對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用[17]。但過量的Cd會通過損傷植物細胞結構、破壞酶活性、抑制根系生長、抑制水分和養分的吸收等方式抑制植物生長甚至導致死亡[18]。不同植物富集鎘的能力不同[19]，不同植物對鎘脅迫的耐受能力差異較大[20-21]，大豆是我國居民日常生活中食用油和蛋白質的主要來源，在農作物中具有較高經濟價值，但是會在籽粒中積累Cd[22]。因此，研究大豆耐Cd脅迫能力，對農業生產及可持續發展具有重要意義。

野生大豆是大豆種質資源優良的基因庫[23-24]，不同大豆品種耐鎘差異及抗鎘毒害效應差異較大。例如，Cd處理條件下，綜合考慮相對生物量和籽粒干重指標，桂夏豆2號、巴西3號是耐性品種。相同Cd脅迫條件下巴西10號、福豆234、華夏4號和中黃24表現出對Cd脅迫較為敏感的特征[25]。2.50 mg/L Cd脅迫條件下，湘春豆13、沔1101大豆株高及生物產量比對照組下降較少，是抗Cd脅迫能力較強的品種[26]。盡管如此，仍有很多優良基因還未被發掘。因此，對野生大豆進行研究，對合理的利用和保護野大豆基因資源具有非常重要的意義[27]。本試驗采用的野生大豆采自山東省東營市的鹽堿地，生存環境惡劣。為評價該野生大豆種質資源的耐鎘能力，通過在不同濃度Cd脅迫條件下，對野生大豆的抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、丙二醛（MDA）及可溶性蛋白（soluble protein）含量的變化情況進行測定，以期為四川地區鎘污染土壤栽培大豆的安全生產提供優質的種質資源。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為山東東營（東經118°5'，北緯38°15'）野生大豆。

1.2 試驗方法

挑選飽滿、成熟度一致的東營野生大豆種子，用砂紙摩擦破皮后，用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min，用去離子水反復沖洗，再將種子放入去離子水中于25℃恒溫培養箱中浸種12 h。然后播種于標準大培養皿，每個培養皿播種50顆，置于光照培養箱（MLR-352H-PC，日本松下）（光照14 h，溫度25.0℃，黑暗10 h，溫度20.0℃、濕度65%）至展開一對子葉。挑選長勢一致的幼苗移栽至裝滿蛭石的圓柱形塑料桶（直徑28 cm、深17 cm）中，每桶4株于植物培養室進行培養，光照強度350μmol/（m2·s），光照時間12 h；晝、夜溫度分別為25.0℃和20.0℃；相對濕度65%～70%。利用營養液1/2 Hoagland配制Cd2+處理溶液：0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L。每3天定期向每桶注入500 mL的Cd2+處理溶液，每個濃度處理3次重復。在Cd脅迫處理45天時開始收集樣品，之后每隔7天收集一次樣品，連續收集4 w。采集東營野生大豆頂端倒數第5、6、7片長勢一致的葉片，去葉脈后約0.5 g，進行相應指標的測定。

1.3 測定方法

每個處理取0.5 g新鮮葉片于預冷的研缽中，加2 mL磷酸緩沖液研磨成漿，加緩沖液使終體積為10 mL，于10 000 r/min下離心10 min，上清液即為提取液，4℃下保存備用。

SOD活性測定采用氮藍四唑光化還原法[28]，以抑制NBT光還原的50%為1個酶活性單位（U/min·g）。POD活性測定采用愈創木酚法[29]，以每分鐘內A470變化0.1為1個酶活性單位（U/min·g）。SOD和POD均采用可見光分光光度計（日本，島津，UV-1760）檢測。

CAT活性測定采用紫外吸收法[30]，以每分鐘內A240減少0.1為1個酶活單位（U/min·g）?？扇苄缘鞍缀康臏y定采用考馬斯亮藍G-250染色法[31]。丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[32]，稱取不同處理濃度的野生大豆鮮葉1 g于預冷的研缽中，加入2mL 10%TCA研磨至勻漿，再加8mL TCA進一步研磨，于4 000 r/min離心10 min，上清為樣品。4℃下保存備用。以上數據均采用雙光束紫外可見分光光度計（A560型，翱藝，UTA13L0006）進行測定。

1.4 數據統計方法

采用Microsoft Excel 2010整理試驗數據，用Origin 9進行數據統計處理及圖表制作，用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，采取Duncan's multiple angetest法進行顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 Cd脅迫對野生大豆葉片抗氧化酶活性的影響

當用Cd處理濃度分別為0.5、2.0、4.0和8.0 mg/L的營養液處理幼苗第45天時，野生大豆SOD活性顯著增加了12.7%，43.3%、49.0%、49.7%。當Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L處理幼苗第52天時，SOD活性顯著增加了10.5%、43.1%、46.7%、45.2%。當Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L處理幼苗第59天時，SOD活性顯著增加了11.6%、16.0%、56.5%、62.1%、57.1%。當Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L處理幼苗第66天時，SOD活性顯著增加了12.7%、17.1%、46.9%、49.8%、41.7%。當Cd脅迫濃度為16.0 mg/L時，野生大豆各個處理時間段的SOD活性相比于對照分別顯著性降低了20.7%、14.7%、17.3%、26.2%。在不同濃度Cd處理條件下，隨著處理時間的延長SOD活性均呈顯著性增加的趨勢（見表1）。

當用含Cd濃度為4.0 mg/L的營養液處理幼苗第45天時，POD的活性顯著增加了31.2%；當用含Cd濃度為2.0、8.0 mg/L的營養液處理幼苗第66天時，POD的活性顯著降低了27.3%，24.8%。當Cd脅迫濃度為16.0 mg/L時，野生大豆各個處理時間段的POD活性相比于對照分別顯著性降低了30.0%、44.2%、53.3%、44.5%。隨著脅迫時間延長，當Cd處理濃度為1.0 mg/L時，POD的活性相比于對照有顯著性增加，而當Cd處理濃度分別為0.25、0.5、8.0、16.0 mg/L時，POD的活性相比于對照都沒有顯著性變化（見表2）。

表1 不同濃度鎘脅迫下野生大豆葉片SOD活性Table 1 SOD activities of wild soybean under Cd stress U·min-1·g-1

表2 不同濃度鎘脅迫下野生大豆葉片POD活性Table 2 POD activities of wild soybean under Cd stress U·min-1·g-1

當用Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0mg/L的營養液處理幼苗第45天時，CAT活性顯著增加了50.3%、41.2%、93.9%、77.6%。當用Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的營養液處理幼苗第52天時，CAT活性顯著增加了28.0%、42.9%、77.4%、93.5%、89.3%；當用Cd濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的營養液處理幼苗第59天時，CAT活性顯著增加了31.5%，41.5%、72.5%、81.5%、4.5%。當用Cd濃度為1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的營養液處理幼苗第66天時，CAT活性顯著增加了26.8%、24.7%、46.8%、46.8%，而當Cd濃度為16.0 mg/L時，CAT活性顯著降低了13.6%。當Cd處理濃度為16.0 mg/L時，隨處理時間的延長CAT活性呈先顯著降低再顯著增加的趨勢，而其他處理濃度則呈顯著性增加的趨勢，如表3所示。

表3 不同濃度鎘脅迫下野生大豆CAT活性Table 3 CAT activities of wild soybean under Cd stress U·min-1·g-1

2.2 Cd2+對野生大豆葉片丙二醛含量的影響

當用Cd濃度為8.0和16.0 mg/L的營養液處理幼苗第45天時，MDA含量顯著增加了21.8%、37.1%。當用Cd濃度為1.0、2.0、8.0和16.0 mg/L的營養液處理幼苗第52天時，MDA含量顯著增加了6.5%、9.5%、14.9%、18.5%。當用Cd濃度為4.0、8.0和16.0 mg/L營養液處理幼苗第59天時，MDA含量顯著增加了16.4%、22.2%、31.6 %；當用Cd濃度為4.0、8.0和16.0 mg/L的營養液處理幼苗第66天時，MDA含量顯著增加了18.2%、22.2%、48.3%，而當Cd處理濃度為0.25和0.5 mg/L時，MDA含量顯著降低了10.2%、9.7%（見圖1A）。當Cd處理濃度為0、4.0 mg/L時，隨處理時間的延長MDA含量呈顯著增加的趨勢。當Cd處理濃度為0.25、0.5 mg/L時，隨處理時間的延長MDA含量呈顯著降低的趨勢。當Cd處理濃度為1.0 mg/L時，隨處理時間的延長MDA含量呈先顯著增加后顯著降低的趨勢。當Cd濃度為16.0 mg/L時，隨處理時間的延長MDA含量呈先顯著降低后顯著增加的趨勢（見圖1B）。

2.3 Cd2+對野生大豆葉片可溶性蛋白含量的影響

當用Cd濃度為4.0 mg/L的營養液處理幼苗第45天時，可溶性蛋白含量顯著增加了76.2%，而Cd處理濃度為0.5和16.0 mg/L時，可溶性蛋白含量顯著降低了4.8%、11.9%。當用Cd濃度為1.0、2.0和4.0 mg/L的營養液處理幼苗第52天時，可溶性蛋白含量顯著增加了23.5%、28.4%、64.2%，而Cd處理濃度為16.0 mg/L時，可溶性蛋白含量顯著降低了16.0%。當用Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L的營養液處理幼苗第59天時，可溶性蛋白含量顯著增加了26.0%、27.3%、92.2%、18.2%。當用Cd濃度為1.0、2.0、4.0和8.0 mg/L的營養液處理幼苗第66天時，可溶性蛋白含量顯著增加了15.9%、14.6%、84.1%、13.4%（見圖2A）。當Cd處理濃度大于等于1.0 mg/L時，隨處理時間的延長可溶性蛋白含量沒有顯著性變化。當Cd處理濃度為0和0.25 mg/L時，隨處理時間的延長可溶性蛋白含量呈顯著性降低的趨勢（見圖2B）。

3 討論與結論

Cd是植物的非必需元素，土壤或水體中過量的Cd被植物吸收后會對植物產生一系列的毒害作用[33]。正常情況下植物體內活性氧的產生和清除處于動態平衡，不會影響植物正常生長。受Cd2+脅迫后，活性氧在植物體內的動態平衡被破壞，導致植物體的自由基代謝失衡，產生諸如O2-（超氧陰離子）和H2O2等大量活性氧[34]。O2-和H2O2的積累能夠氧化生物分子，打破活性氧代謝平衡導致膜脂過氧化進而破壞細胞膜的結構和功能。丙二醛則是膜脂過氧化作用的最終產物，它的積累能夠反映植物體內自由基的活動狀態，其含量越高反應植物膜脂過氧化程度越高[35]。本研究中，隨著Cd處理濃度的增加，MDA的含量呈顯著增加的趨勢，表明野生大豆植物體內活性氧大量積累，并激活了植物體內的抗氧化系統，誘導抗氧化酶活性發生了改變[36-37]。

SOD、POD和CAT是植物體內存在的一組有效清除細胞內活性氧的抗氧化酶系統。SOD、POD、CAT這3種酶活性峰值所對應的處理時間和濃度不同，說明它們通過不同的耐脅迫機理共同協作清除植物體內氧化物，減輕不利的生長條件下帶來的氧化傷害[38]。SOD能夠催化O2-轉化為H2O2，POD和CAT能夠將H2O2分解為無毒的水，三者共同作用能夠在一定程度上緩解或防御鎘脅迫的傷害，對保護細胞膜的完整性和防御活性氧對細胞膜的傷害有重要作用[39-40]。本試驗中，當Cd濃度小于等于8.0 mg/L時，SOD、CAT活性升高，這與棉花、擬南芥等作物在Cd2+脅迫下的反應一致[41-42]。盡管在該濃度范圍內MDA含量增加，但受SOD、POD、CAT的保護作用，降低了植物受到的過氧化損傷。在東營野生大豆抗氧化酶系統中可能主要由SOD和CAT清除活性氧帶來的傷害，POD起輔助作用，此調節機制能使植物適應并抵抗一定程度的傷害。

圖1 鎘脅迫下野生大豆的MDA含量Figure 1 The MDA content of wild soybean under Cd stress

重金屬離子進入植物體后，與其他化合物結合成金屬絡合物或螯合物，抑制植物各種代謝活動尤其是蛋白質的合成。因此，可溶性蛋白質含量是衡量植物是否發生重金屬脅迫的重要指標[43]。低濃度的Cd溶液會導致可溶性蛋白含量增加，而可溶蛋白質含量的提高很可能是植物抵抗鎘毒害的一種解毒機制，例如鎘能誘導產生鎘結合蛋白，而降低鎘的毒性。可溶蛋白質含量的提高，還會增加細胞滲透濃度和功能蛋白的數量，有助于維持細胞正常代謝[44]。本研究中，當Cd濃度小于等于8.0 mg/L時，可溶性蛋白含量呈顯著增加的趨勢，表明東營野生大豆緩解了Cd脅迫帶來的不利影響，降低了Cd脅迫帶來的危害。

當Cd處理濃度為16.0 mg/L時，SOD、POD、CAT活性顯著低于對照，MDA含量升高，可溶性蛋白含量降低，說明在此濃度處理下植物體內的活性氧代謝平衡被打破，活性氧自由基大量產生導致細胞膜脂過氧化加劇，野生大豆的抗氧化系統已經受到損傷[45-46]。高濃度Cd會加速原有蛋白質的分解以及破壞合成蛋白質的細胞器抑制蛋白質合成從而對細胞產生毒害作用[47]。在該濃度條件下，可溶性蛋白含量顯著降低表明野生大豆中Cd進入細胞后很可能促進了蛋白水解酶的活性，加強了原有蛋白質分解，或者使蛋白質合成的相關細胞器受到損傷，抑制了新蛋白的合成[48]。本研究結果表明，當Cd處理濃度為16.0 mg/L時，野生大豆無法通過自身調節抵消Cd脅迫帶來的危害，生長明顯受到抑制。

圖2 鎘脅迫下野生大豆的可溶性蛋白含量Figure 2 The soluble protein content of wild soybean under Cd stress

綜上所述，當Cd脅迫濃度小于等于8.0 mg/L時，野生大豆植株通過激活抗氧化酶系統以及可溶性蛋白含量的變化防御不同濃度鎘脅迫帶來的氧化傷害，減輕或緩解鎘脅迫帶來的不利影響，東營野生大豆能正常生長。東營野生大豆為抗Cd能力較強的種質資源。利用東營野生大豆優良基因資源，可豐富生產實踐過程中的大豆基因庫，為四川地區栽培大豆在鎘污染地區的安全生產提供種質資源。