ACE2基因多態性與2型糖尿病腎病的相關性

劉媛媛，姜永瑋，楊 輝，叢 笑，曹永彤

（1.中日友好臨床醫學研究所，北京 100029；2.中日友好醫院 檢驗科，北京 100029）

據國際糖尿病聯盟（IDF）統計，中國2017年糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）的患病人數為1.14億，到2045年將達到1.2億[1]。糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）作為糖尿病最嚴重的慢性并發癥之一，其患病率也逐年上升，男性的發病率高于女性[2]。ACE與ACE2表達失調被認為可能與DKD的發生發展相關。ACE2基因位于X染色體，相關的動物實驗證實ACE2缺乏對不同性別的糖尿病小鼠模型會產生不同的影響，ACE2基因敲除的雄性小鼠可出現血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）介導的腎小球損傷[3]。目前對于ACE2基因多態性的研究較少，本文旨在研究ACE2基因rs2285666多態與不同性別的2型糖尿?。═2DM）患者并發DKD的關系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選擇2016年6月～2018年3月中日友好醫院收治的T2DM患者，年齡在62.3±11歲。T2DM的診斷分型參照1999年世界衛生組織（WHO）修訂的糖尿病診斷及分型標準，同時排除近期內用過腎毒性藥物、妊娠、腫瘤、尿路感染、心力衰竭、活動性結核、精神病等疾病。根據2014年中華醫學會糖尿病學分會（CDS）微血管并發癥學組工作建議，將符合以下條件的納入 DKD（+）組：（1）大量白蛋白尿 （診斷標準：ACR＞300，3-6個月內復查，3次結果中至少2次查過臨界值，并排除影響因素如24h內劇烈運動、感染、發熱、明顯高血糖）；（2）糖尿病視網膜病變合并慢性腎臟病[慢性腎臟病診斷標準：GFR＜60ml/（min·1.73m2），且至少滿足1條腎臟受損標志：UACR≥30；尿沉渣異常；腎小管相關疾??；組織學異常；影像學所見結構異常；腎移植病史]；（3）滿足以上任1條并排除其他疾病引起的蛋白尿及腎功能不全：出現腎損傷但不伴糖尿病視網膜病變；蛋白尿急劇增多或腎病綜合征；頑固性高血壓；出現尿活動性沉渣等。符合以下條件的納入DKD（-）組：滿足T2DM病程≥10年，且 UACR＜30。

以上全部研究對象均來自中國漢族人群，且無血緣關系。本研究通過本院倫理委員會批準（批號：2016-59），所有研究對象均簽署臨床研究知情同意書，入選575例研究對象，排除32例（包括符合以上排除標準者28例，失訪者4例），共計納入543例：其中 DKD（+）組 271例，包括男性 145例和女性 126例；DKD（-）組 272例，包括男性134例和女性138例。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床及生化指標

通過查詢病歷系統收集患者年齡、性別、身高、體重、體質指數（BMI）、血壓、吸煙史及視網膜病變史等臨床資料。檢索檢驗科數據庫收集患者外周血總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、血肌酐（Scr）、腎小球濾過率（eGFR）、內生肌酐清除率（Ccr）、尿素（Urea）以及尿 UACR 等檢測結果。 以上生化項目由Beckman Coulter AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）進行檢測。

1.2.2 引物設計及合成

采集患者空腹外周靜脈血1ml，應用全血基因組DNA快速提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）提取基因組DNA。根據genbank上ACE2的基因序列，采用引物設計軟件primer5設計引物， 上游引物 F：5’-TACAATGAGCACCATCTACAGT-3’，下游引物 R：5’-TACAATGAGCACCATCTACAGT-3’。由北京擎科生物公司合成。

1.2.3 PCR-HRM

儀器采用Roche Light Cycler 480實時熒光定量PCR儀 （瑞士羅氏公司）；試劑采用Light CyclerR480 High Resolution Melting Master，Version 07（德國羅氏公司）。優化反應條件確定反應體系：總體積為 20μl，包含 Master Mix（2×）10μl，MgCl2（25 mmol/L）2μl，上、下游引物（10μmol/L）各 0.5μl，DNA 模板（10ng/μl）5μl，滅菌超純水 2μl補足體系。在Light CyclerR480實時熒光定量PCR儀上設置PCR-HRM反應程序如下：①95℃預變性10min。②40個循環的熒光定量Touchdown PCR 程序如下：95℃變性 10s，60℃退火 15s，72℃延伸15s，每次延伸完成后獲取1次熒光信號。③HRM程序如下：95℃變性1min，40℃退火1min，65℃～97℃上升 0.02℃/s，每上升 1℃獲取 25個信號，獲得溶解曲線。④40℃冷卻30s完成實驗。

1.2.4 目的基因測序分析

①PCR擴增：PCR體系為50 μl，其中包括反應混合物Mix（包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mgcl2、反應緩沖液）25μl，引物混合物 4 l，DNA 樣本8μl，滅菌超純水補足體系。采用TC-C1000 Touch熱循環儀（美國Bio-Rad公司）進行擴增，熱循環參數為：預變性95℃ 2min；再按下列程序循環30次，即 95℃變性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s；末次循環后，72℃延伸5min。擴增產物送北京擎科生物公司進行測序。②序列比對：將獲得的基因序列在PubMed網站的BLAST中進行序列比對，結合HRM結果做出最終判斷，以此作為陽性對照進行分型。

表1 DKD（-）組與 DKD（+）組臨床資料比較

1.3 統計學方法

研究數據采用SPSS17.0軟件進行分析。DKD（+）組和 DKD（-）組 ACE 基因 rs2285666 多態性基因型分布，采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，采用直接計數法計算各組ACE基因rs2285666多態性的基因型和等位基因頻率，計數資料組間比較采用χ2檢驗。對于符合正態分布的計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料組間比較采用Mann-Whiteney U檢驗。各組不同基因型受試者的計量資料比較，采用單因素方差分析。多因素分析采用非條件Logisitic回歸分析。

2 結果

2．1 受試者相關臨床資料比較

DKD（+）組與 DKD（-）組及 2 種基因型的一般臨床資料見表1，2組男性患者臨床資料比較，年齡、BMI DBP、TC、TG、HDL-C、LDL-C、HCY 差異均無統計學意義（P＞0.05）。 DKD（+）組病程、吸煙比例、SBP、HbA1c、Scr水平高于 DKD （-） 組，eGFR、Ccr低于 DKD（-）組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。女性患者中，病程、吸煙比例、SBP、HbA1c、Scr、HCY 高于 DKD （-） 組，eGFR 低于DKD（-）組，差異均有統計學意義（P＜0.05），其余資料差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 2組受試者ACE基因rs2285666多態性基因型及等位基因頻率比較

本研究女性受試者的ACE2基因rs2285666多態性分布，均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律 （P＞0.05）。DNA樣品經HRM分析結果見圖1（封三）。抽樣測序分析結果見圖2（封三）。2種方法分型結果保持一致。2組受試者等位基因頻率的比較見表2。男性患者中，DKD（+）組G基因頻率顯著高于 DKD （-） 組 （53.1%比 37.3%，P＜0.01）。 女性患者中，DKD（+）組 GG基因型高于DKD（-）組（28.6%比 15.9%，P＜0.05）。

圖1 DNA樣品HRM分析結果

圖2 ACE2 G8790A測序分析結果

2.3 rs2285666基因分型和DKD的相關性

使用2種統計模型，分別是未校正和校正了病程、 吸煙、SBP、HbA1c、Ccr、eGFR 和 HCY 的影響。表3示，ACE2 G8790A變異增加了DKD風險，其中女性患者在加性遺傳模型在DKD（+）和DKD（-）組中的差異有統計學意義（校正后OR=1.56，95%CI=1.03～2.37，P＜0.05）。相對于 AA 和GA基因型，GG基因型在加性遺傳模型中均顯著提升了DKD的患病風險（P＜0.05）。而男性患者中攜帶G等位基因進展為DKD的風險顯著高于A等位基因（校正后 OR=1.97，95%CI=1.15～3.37，P＜0.05）。

表2 DKD（+）組和 DKD（-）組患者ACE基因型和等位基因頻率比較 n（%）

表3 T2DM并發DKD相關因素的Logistic回歸分析

3 討論

DKD是T2DM最主要、最嚴重的微血管并發癥之一，在發達國家30%～40%的糖尿病患者并發DKD，是導致終末期腎臟?。╡nd stage renal disease，ESRD）的首要原因[4]。 在中國，T2DM 并發DKD是導致ESRD的第二位病因（16.4%）[5]。DKD的發病機制尚未明確，主要認為是遺傳因素與環境因素共同作用的結果。腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）被認為可以通過改變腎臟血流動力學、參與氧化應激等多種途徑參與DKD的發生與進展，相關研究表明DKD患者的腎臟RAS的代償水平存在性別差異[6]。血管緊張素轉換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是近年來發現的RAS系統的新成員，是2000年由Donoghue等[7]從心衰患者心室組織的cDNA文庫中克隆出一種新的ACE同源物。ACE2基因定位于Xp22，包含18個外顯子，該基因的突變可能通過影響性激素而間接影響RAS的表達，從而引起不同性別的DM患者進展為DKD的風險存在差異。Clotet等[8]的實驗表明ACE2基因敲除的雄性小鼠可出現腎ACE水平和活性增高，而雌性小鼠無差異。ACE2可對抗ACE與AngⅡ，促進Ang-（1-7）的生成，發揮舒張血管、抗組織纖維化、抗增殖和利尿等作用。在腎臟，局部內皮細胞和腎小管上皮細胞ACE2活性增高，可調節腎血流分布、水電解質的平衡，從而在維持血壓穩定的同時保護腎功能。

既往通過對ACE2基因測序檢出G8790A（rs2285666）多態位點，即第3個內含子第4個堿基存在G—A突變，該位點的變異可以改變mRNA的剪接，可能對基因的功能產生影響，因此可能與疾病遺傳易感性有關，已有的研究表明該位點多態性與高血壓伴心功能不全有關。目前國內外對于ACE2基因rs2285666多態性與DKD的關系的研究較少，且結果并不一致，可能與種族差異、研究方法不同有關。既往有關ACE2基因G8790A多態性的研究，多采用PCR-RFLP技術，技術操作繁瑣，易造成污染出現假陽性，且結果可能出現拖帶影響判讀，影響結果的準確性，故有待于進一步改進。本研究采用目前檢測SNP較為新型的HRM法，同時隨機抽取30例樣本進行測序驗證，兩種方法的檢測結果保持一致，表明應用HRM技術檢測ACE2基因G8790A多態性是可行的。HRM技術的原理是在PCR擴增前在體系中加入飽和熒光染料，該熒光染料可嵌入至雙鏈DNA間，在激發光的作用下散發熒光，而該染料不與單鏈DNA結合，在激發光的作用下不發出熒光。隨著溫度逐漸上升，DNA雙鏈漸打開，熒光強度漸減弱。不同樣本的DNA雙鏈因GC含量不同，排列順序不同，因而呈現出不同的熔解曲線。由于ACE2基因的第3個內含子第4個堿基存在G-A突變，GC間氫鍵斷裂所需的能量與AT間氫鍵斷裂所需的能量不同，因此呈現出不同的熔解曲線。HRM技術的優點在于PCR擴增完成后只需運行一個升溫程序即可完成檢測，且結果準確、成本較低、操作簡便、可以達到閉管操作從而避免污染，因此是一種快速、準確檢測ACE2基因G8790A基因多態性的優選方法。

Frojdo等[9]用PCR-RFLP法分析了芬蘭地區823例糖尿病患者ACE2基因G8790A多態性與DKD的關系，其中包括365例DKD和458例非DKD患者，結果表明DKD組與非DKD組的基因分布無明顯差異，該位點突變與DKD無關。馬增霞等[10]采用PCR-RFLP法的研究認為DKD組男性患者A基因頻率（59.6%）明顯升高，G基因頻率（40.4%）顯著降低（P＜0.05）。攜帶 A 等位基因的T2DM男性患者更易發生DKD，G等位基因則為保護性基因。本研究應用HRM法對2型糖尿病合并DKD患者271例及2型糖尿病不伴DKD患者272例進行了ACE2基因rs2285666多態的分析，觀察到男性患者中G等位基因的頻率在DKD患者中明顯升高（P=0.008）。在校正了病程、吸煙 、SBP、HbA1c、Ccr、eGFR 和 HCY 等的 影響后，發現在女性患者加性遺傳模型中，G等位基因在兩組間的差異有統計學意義（P=0.03），GG基因型在加性遺傳模型中顯著提升了DKD的患病風險（P＜0.05）。 該結果與 Li等[11]的研究結果保持一致。在男性患者中，DKD（+）組攜帶G基因頻率顯著高于 DKD（-）組（校正后 P=0.013），因此，G 基因是男性DKD發病的獨立危險因素。本研究對2型糖尿病合并DKD患者271例及2型糖尿病病程≥10年且不伴DKD患者272例進行了ACE2基因rs2285666多態性的研究，具有比較好的統計學效力，但仍有一定局限性。本研究是在漢族2型糖尿病患者中進行的，結果是否可以推廣到其他民族，還需要進一步的調查。本研究為病例對照研究，還需要開展大樣本前瞻性研究，并進一步檢測不同基因型的酶表達水平來驗證rs2285666基因型與DKD的關系。

DKD發病機制尚未完全闡明，本研究提示遺傳因素在2型糖尿病患者DKD的發病中具有一定的作用，對于ACE2基因 rs2285666多態性的研究有可能為DKD的基因診斷及治療提供依據，本研究同時為該多態性的研究提供了新的方法，只有明確遺傳易感個體，盡早進行相關的干預治療，才能控制和延緩DKD進展、改善患者的生活質量及減輕社會的的經濟負擔，ACE2基因rs2285666多態性與DKD的關系還需要進一步開展大樣本前瞻性研究加以驗證。