RRM1 mRNA與吉西他濱藥物膀胱灌注治療膀胱癌療效的關(guān)系

劉志飛 ，張志宏 ，邢力永 ，朱研峰 ，石 鵬 ，鄧 剛

（1．天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津300211；2.唐山市人民醫(yī)院泌尿外科，唐山063000）

膀胱癌為泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，隨著社會(huì)發(fā)展，人們生活水平的提高，目前其發(fā)病率愈發(fā)升高，且明顯呈現(xiàn)低齡化趨勢(shì)，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)后非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者在早期及時(shí)給予膀胱灌注吉西他濱藥物已作為一種較好的輔助治療方案，然而，目前對(duì)于如何監(jiān)測(cè)非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者對(duì)吉西他濱藥物的敏感性尚待進(jìn)一步解決。國(guó)外學(xué)者已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)核糖核苷還原酶M1亞單位基因（RRM1）表達(dá)水平與膀胱癌患者生存時(shí)間有重要關(guān)系，通過檢測(cè)RRM1的表達(dá)水平可以評(píng)估膀胱癌患者膀胱灌注化療藥物的敏感程度，對(duì)臨床上選擇輔助治療方案具有重要指導(dǎo)意義[1]。本研究通過DNA基因液相芯片技術(shù)檢測(cè)膀胱癌組織中RRM1的表達(dá)水平，分析RRM1與膀胱癌患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)的相關(guān)性及與膀胱灌注吉西他濱藥物療效的敏感性，旨在為日后臨床上膀胱癌患者術(shù)后行膀胱灌注治療選擇最佳化療藥物提供一定的指導(dǎo)依據(jù)[2]。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析唐山市人民醫(yī)院自2013年1月-2017年3月的40例行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者。患者年齡為31～78歲，中位年齡為（57.6±8.9）歲；男性患者 23例，女性患者17例；腫瘤最大直徑0.8～3.5 cm，直徑≥2 cm為16例，直徑＜2 cm為24例；腫瘤單發(fā)為23例，腫瘤多發(fā)為17例。術(shù)后病理結(jié)果顯示均為非肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌，其中高級(jí)別尿路上皮癌患者18例，低級(jí)別尿路上皮癌患者22例。術(shù)后所有患者均行吉西他濱藥物膀胱灌注1年（吉西他濱注射液1 g與50 mL 0.9%NaCl注射液配組灌注，保留灌注時(shí)間1 h，初始為1次/周，共計(jì)8周，后改為1月/次，共計(jì)8月），術(shù)后隨訪膀胱灌注吉西他濱藥物的膀胱癌患者復(fù)發(fā)情況，通過行泌尿系彩超、CT、膀胱鏡檢查診斷患者是否出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)，隨訪1年期間膀胱癌復(fù)發(fā)患者6例（表1）。

表1 RRM1 mRNA的表達(dá)與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系（例）Tab 1 Relationship between the expression of RRM1 mRNA and the clinicopathological features of bladder cancer(cases)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取適量術(shù)后新鮮標(biāo)本組織與裂解液混勻，溫度設(shè)為65℃，1 400 r/min振蕩孵育2 h。然后溫度設(shè)為25℃，13 000 r/min離心5 min，取上層清液，作為樣本檢測(cè)。將上層清液轉(zhuǎn)移至96孔板，加入支持探針-微球、支持延伸探針、緩沖液，溫度調(diào)為54℃，750 r/min振蕩14～18 h。次日將孵育板放在磁力架上1 min，棄去上層清液。加入洗滌液，震蕩洗滌1 min，棄去上層清液；重復(fù)洗滌4次。加入擴(kuò)增延伸探針和標(biāo)記探針，溫度設(shè)為45℃震蕩反應(yīng)1 h；棄去上層清液；用洗滌液洗3次；加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，溫度設(shè)為50℃震蕩反應(yīng)30min；用洗滌液洗2次；加入洗滌液，震蕩5 min，于Luminex閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的物質(zhì)為mRNA，本研究以mRNA體現(xiàn)蛋白表達(dá)水平）。

1.3 結(jié)果判定 通過讀取Luminex IS2.3儀器顯示結(jié)果，其中RRM1 mRNA在膀胱癌組織中檢測(cè)表達(dá)率＜50%為低表達(dá)，≥50%為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件，描述分析40例膀胱癌患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤單發(fā)或多發(fā)、腫瘤組織分級(jí)、RRM1 mRNA的表達(dá)水平等臨床病理特征的分布情況，對(duì)RRM1 mRNA的表達(dá)及其與非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤單發(fā)或多發(fā)、腫瘤組織分級(jí)等臨床病理特征的關(guān)系及RRM1 mRNA的表達(dá)水平與吉西他濱藥物敏感性的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將P＜0.05作為其間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

40例非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者中檢測(cè)出RRM 1 mRNA高表達(dá)為16例，表達(dá)率為40%；RRM1mRNA低表達(dá)為24例，表達(dá)率為60%。RRM1 mRNA的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤單發(fā)或多發(fā)等參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)。

膀胱癌患者RRM1表達(dá)水平與膀胱癌分級(jí)的關(guān)系（表2），RRM1在高級(jí)別膀胱尿路上皮癌患者中呈現(xiàn)高表達(dá)為12例（30%），呈現(xiàn)低表達(dá)為6例（15%）；在低級(jí)別尿路上皮癌患者中高表達(dá)為4例（10%），低表達(dá)為18例（45%）。高級(jí)別尿路上皮癌與低級(jí)別尿路上皮癌患者中RRM1表達(dá)水平行χ2檢驗(yàn)（1），所以 P＜0.05，因此高級(jí)別膀胱癌患者與低級(jí)別膀胱癌患者中RRM1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高級(jí)別尿路上皮癌患者中RRM1水平呈現(xiàn)高表達(dá)，低級(jí)別尿路上皮癌患者RRM1水平呈現(xiàn)低表達(dá)。

表2 RRM1在不同病理分級(jí)膀胱癌中的表達(dá)情況(例)Tab 2 Expression of RRM1 in bladder cancer with different pathological grades(cases)

膀胱癌患者RRM1的表達(dá)水平與膀胱灌注吉西他濱藥物治療效果敏感性關(guān)系（表3）：術(shù)后隨訪膀胱灌注吉西他濱藥物的膀胱癌患者復(fù)發(fā)情況，其中RRM1低表達(dá)的患者復(fù)發(fā)1例（2.5%），RRM1高表達(dá)的患者復(fù)發(fā)5例（12.5%），RRM1高表達(dá)患者復(fù)發(fā)率是RRM1低表達(dá)患者的5倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析χ2=6.3 ＞χ20.052（1），所以 P＜0.05，表明經(jīng)吉西他濱藥物膀胱灌注的膀胱癌患者中RRM1高表達(dá)的尿路上皮癌患者復(fù)發(fā)率明顯高于RRM1低表達(dá)的尿路上皮癌患者，所以吉西他濱藥物在RRM1低表達(dá)膀胱癌患者中療效優(yōu)于RRM1高表達(dá)患者。

表3 RRM1與吉西他濱藥物敏感性關(guān)系(例)Tab 3 Relationship between RRM1 and the sensitivity of gemcitabine drug(cases)

3 討論

非肌層浸潤(rùn)膀胱癌患者行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TUR-BT）術(shù)后早期進(jìn)行膀胱灌注敏感的化療藥物可以降低患者術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)[3]，同時(shí)也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者術(shù)后行膀胱內(nèi)灌注化療藥物，術(shù)后復(fù)發(fā)率仍可達(dá)60%[4]。核糖核苷還原酶M1亞單位基因（RRM1）為DNA修復(fù)過程的限速酶[5]，定位于染色體11P15.5，這個(gè)染色體區(qū)域命名為L(zhǎng)0H11A。Bergman研究表明RRM1基因是促使吉西他濱產(chǎn)生耐藥的關(guān)鍵性靶點(diǎn)[6]。吉西他濱進(jìn)入機(jī)體后，其吉西他濱RR的活性被吉西他濱磷酸化產(chǎn)物所競(jìng)爭(zhēng)性抑制，導(dǎo)致dNTPs少量生成或不再生成，由于dNTPs是DNA合成所必需的底物[7]，所以抑制RR的活性便可以阻止DNA的合成從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，達(dá)到阻止腫瘤細(xì)胞增殖的目的[8]。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道非小細(xì)胞肺癌患者在進(jìn)行鉑類及吉西他濱聯(lián)合化療時(shí)，mRNA表達(dá)水平較低的患者化療后具有相對(duì)較長(zhǎng)的生存期，表明RRM1基因是研究吉西他濱耐藥的一個(gè)主要指標(biāo)[9]。Reynolds等[10]研究發(fā)現(xiàn)，RRM1和ERCC1蛋白表達(dá)水平與化療有效率之間具有顯著的相關(guān)性，高表達(dá)者有效率低，二者在膀胱癌患者術(shù)后膀胱灌注化療藥物中有何作用仍需進(jìn)一步研究，該研究結(jié)果將會(huì)在臨床上為患者提供個(gè)體化治療方案[11]。

本文結(jié)果表明RRM1的表達(dá)水平與膀胱癌腫瘤分級(jí)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，經(jīng)吉西他濱藥物膀胱灌注的膀胱癌患者中RRM1低表達(dá)的尿路上皮癌患者復(fù)發(fā)明顯低于RRM1高表達(dá)的尿路上皮癌患者，由此表明嘧啶類藥物在RRM1低表達(dá)膀胱癌患者中療效優(yōu)于RRM1高表達(dá)患者。高級(jí)別尿路上皮癌與低級(jí)別尿路上皮癌患者術(shù)后均可出現(xiàn)復(fù)發(fā)，筆者發(fā)現(xiàn)高級(jí)別尿路上皮癌患者中RRM1 mRNA高表達(dá)者對(duì)吉西他濱藥物灌注療效差，易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，而低級(jí)別膀胱癌患者中RRM1 mRNA高表達(dá)者同樣對(duì)吉西他濱藥物灌注療效差容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，這表明RRM1 mRNA表達(dá)水平與吉西他濱藥物灌注療效呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。此結(jié)果與國(guó)內(nèi)外多位學(xué)者研究相符。RRM1表達(dá)水平與患者預(yù)后有密切相關(guān)性，其表達(dá)狀況直接影響化療藥物的選擇，RRM1活性升高或表達(dá)水平升高均會(huì)導(dǎo)致化療藥物的耐藥性產(chǎn)生。因此，非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者行膀胱灌注治療前通過檢測(cè)RRM1基因表達(dá)水平，有助于判斷吉西他濱藥物敏感性，可以為患者選擇最敏感的膀胱灌注藥物提供一定指導(dǎo)依據(jù)，由于本研究數(shù)據(jù)有限，可能存在一定偏倚，尚需擴(kuò)充研究對(duì)象數(shù)量以進(jìn)一步探討RRM1在膀胱灌注治療選擇合理藥物中的重要性。