基于芯片數(shù)據(jù)的雌激素受體陽性乳腺癌他莫昔芬耐藥相關(guān)基因分析

王世霞，楊艷芳，馬 寧，劉 君

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤二科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060）

近年來，中國的乳腺癌發(fā)病率正在逐年增加[1]。在美國，乳腺癌是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡的首要原因，也是最常見的腫瘤[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌中約有70%~80%表達(dá)雌激素受體（estrogen receptor，ER）[3-4]。內(nèi)分泌治療是ER陽性乳腺癌的一線治療方案，能夠顯著降低ER陽性乳腺癌患者的死亡率及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。然而，臨床上發(fā)現(xiàn)約50%的ER陽性乳腺癌對(duì)內(nèi)分泌治療表現(xiàn)出固有耐藥，而對(duì)他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）治療有反應(yīng)的患者中約30%～40%發(fā)展為獲得性耐藥。TAM耐藥的機(jī)制與許多因素有關(guān)，如原癌基因的激活，抑癌基因的失活，ER表達(dá)的改變，共調(diào)節(jié)蛋白的改變以及生長因子信號(hào)通路的影響等[5]。因此，TAM耐藥的現(xiàn)象依然是臨床診療中的難題。

隨著人類基因組計(jì)劃的啟動(dòng)和開展，促進(jìn)了生物信息學(xué)的興起和迅猛發(fā)展。目前生物信息學(xué)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的研究，其在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的地位也越來越重要。它在疾病基因篩查和診斷、生物相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮了不可替代的作用，例如利用生物信息學(xué)工具已發(fā)現(xiàn)與肥胖、高血壓、糖尿病、腫瘤等疾病相關(guān)的致病基因，為疾病診斷及治療提供方向[6]。另外，在遺傳病監(jiān)測、腫瘤鑒別等領(lǐng)域，基因診斷技術(shù)得到廣泛應(yīng)用；功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等為腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究、靶向藥物的篩選和研發(fā)提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。充分并有效地利用生物信息學(xué)工具，如數(shù)據(jù)庫、軟件等，無論是從分子水平的角度進(jìn)行闡述病因，還是對(duì)疾病的診斷、治療、預(yù)防與藥物研發(fā)都將產(chǎn)生強(qiáng)大的推動(dòng)作用。本研究中應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)及工具，利用共享數(shù)據(jù)資源分析TAM耐藥乳腺癌的基因表達(dá)譜并篩選TAM耐藥和TAM敏感乳腺癌之間的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），同時(shí)構(gòu)建DEGs編碼的蛋白質(zhì)間的相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，分析并發(fā)掘潛在的與TAM耐藥相關(guān)的基因，為進(jìn)一步深入研究TAM耐藥的機(jī)制提供新的線索，尋找ER陽性乳腺癌TAM耐藥潛在的新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究使用GEO數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中由Elias D等提交的mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)（登錄號(hào)GSE67916）[7]，由 GPL570 芯片平臺(tái)產(chǎn)生(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array；Affymetrix，Inc.,Santa Clara，CA，USA）。該芯片平臺(tái)包含人類基因組47 000多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，4 895個(gè)序列，138 052個(gè)樣本。其芯片數(shù)據(jù)庫來源于Gen Bank、db EST和Ref Seq。GSE67916中18例樣本均來自于ER陽性乳腺癌患者，包括 4株TAM耐藥細(xì)胞系TamR1、TamR4、TamR7、TamR8和1株TAM敏感的細(xì)胞系MCF7/S0.5，其中TamR1和TamR4各有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)以及TamR7和TamR8各有兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)；MCF7/S0.58個(gè)生物重復(fù)。經(jīng)RNA提取、擴(kuò)增和逆轉(zhuǎn)錄等步驟，最后與Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0芯片雜交、標(biāo)準(zhǔn)化處理等得到并上傳GEO數(shù)據(jù)庫。本研究采用10例TAM耐藥（登錄號(hào)GSM1658401～GSM1658410）和 8例TAM 敏感（登錄號(hào)GSM1658411～GSM1658418）乳腺癌樣本。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá) 利用GEO2R在線工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）對(duì) 數(shù) 據(jù)進(jìn)行處理和分析。按照差異表達(dá)倍數(shù)絕對(duì)值＞1.5，P＜0.01的標(biāo)準(zhǔn)篩選TAM耐藥和TAM敏感樣本之間的DEGs。

1.2.2 GO功能及KEGG通路富集分析 基因本體論（GO）由Gene Ontology聯(lián)合會(huì)系統(tǒng)地整理，是一套層次型的基因功能注釋和分類系統(tǒng)，旨在方便地查詢和更新的基因功能注釋信息[8]。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫可以快速的查找基因參與的信號(hào)通路[9]。使用在線軟件 DAVID（版本 6.8，http：//david.abcc.ncifcrf.gov）中GO功能和KEGG通路富集分析模塊對(duì)篩選的DEGs進(jìn)行分析，納入標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

1.2.3 構(gòu)建蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)） STRING在線工具收集了多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間功能互作的信息[10]，利用該工具對(duì)DEGs的蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行構(gòu)建并分析；使用Cytoscape軟件[11]對(duì)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制，篩選關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因（degree＞20）；同時(shí)應(yīng)用Cytoscape的MCODE插件鑒定及分析成員間顯著緊密連接的子網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選 根據(jù)設(shè)定的條件參數(shù)（差異表達(dá)倍數(shù)絕對(duì)值＞1.5，P＜0.01）共篩選出438個(gè)顯著差異基因，其中上調(diào)差異基因300個(gè)，下調(diào)差異基因138個(gè)。

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析 利用DAVID對(duì)上調(diào)及下調(diào)差異基因所參與的分子功能、生物過程和細(xì)胞成分進(jìn)行分析。其中上調(diào)基因參與的主要分子功能（MF）有：蛋白質(zhì)結(jié)合、poly（A）RNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等；生物過程（BP）有：蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)節(jié)、DNA模板化等；細(xì)胞成分（CC）有：細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)、細(xì)胞膜等。下調(diào)基因參與的主要分子功能（MF）有：蛋白質(zhì)結(jié)合，激酶活性，細(xì)胞粘附的鈣粘蛋白結(jié)合等；生物過程（BP）有：細(xì)胞對(duì)雌二醇刺激的反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，DNA模板化和干擾素γ介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑等；細(xì)胞成分（CC）有：質(zhì)膜、胞外外泌體、細(xì)胞質(zhì)等。

2.3 上調(diào)及下調(diào)差異基因的KEGG通路富集分析 通過DAVID分析，上調(diào)差異基因主要集中在白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移，溶酶體和RIG-I樣受體信號(hào)傳導(dǎo)通路等，下調(diào)差異基因主要集中在：病毒致癌作用，甲狀腺激素信號(hào)通路，調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路等（圖1）。

圖1 上調(diào)及下調(diào)差異基因的KEGG通路富集分析Fig 1 KEGG pathway analysis for up-regulatedand downregulated genes

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 基于STRING的數(shù)據(jù)分析共發(fā)現(xiàn)629組蛋白間的相互作用關(guān)系，PPI網(wǎng)絡(luò)由288個(gè)節(jié)點(diǎn)和 629個(gè)邊緣組成，其中 MAPK1、ESR1、SMARCA4、RANBP2、PRKCA 編碼的蛋白與其他超過20個(gè)蛋白之間存在相互作用關(guān)系（degree＞20），是PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白（圖2）。利用Scytoscape軟件的MCODE插件共分析出兩個(gè)子網(wǎng)（子網(wǎng)1和子網(wǎng)2）（圖3），關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白同時(shí)包含在子網(wǎng)絡(luò)中。

圖2 差異表達(dá)基因的蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig2 Protein-protein interaction network of differentially expressed genes

2.5 子網(wǎng)絡(luò)的GO功能和KEGG通路富集分析 利用DAVID對(duì)兩個(gè)子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，子網(wǎng)絡(luò)1主要與蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、核質(zhì)、免疫應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)、DNA模板化相關(guān)，主要通路富集在病毒致癌作用等（圖4）。子網(wǎng)絡(luò)2主要與細(xì)胞核、細(xì)胞外外泌體、蛋白質(zhì)和DNA的結(jié)合等功能有關(guān)（圖5）。此外，子網(wǎng)2中最主要的通路富集是MAPK信號(hào)通路（圖5）。

圖4子網(wǎng)絡(luò)1的GO功能和KEGG通路富集分析Fig 4 GO and KEGG pathway analysis for genes in sub-network 1

圖5 子網(wǎng)絡(luò)1的GO功能和KEGG通路富集分析Fig 5 GO and KEGG pathway analysis for genes in sub-network 1

3 討論

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展與應(yīng)用，TAM耐藥機(jī)制在基因水平方面的研究已取得重大進(jìn)展。許多基因已被證實(shí)與TAM耐藥相關(guān)，如乳腺癌擴(kuò)增性抗原1（AIB1），50%以上的乳腺癌組織中存在AIB1的過表達(dá)。已有研究證明AIB1基因與TAM耐藥相關(guān)，在TAM耐藥細(xì)胞BT474中敲除AIB1基因，可恢復(fù)對(duì)TAM的敏感性[12]。作為一種分泌蛋白，前梯度蛋白2（AGR2）是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）家族的成員。TAM能刺激AGR2高表達(dá)，同時(shí)AGR2在TAM耐藥中也發(fā)揮重要作用[13]。人表皮生長因子受體2（HER2）和G蛋白偶聯(lián)型雌激素受體（GPER）被證明也與TAM耐藥相關(guān)[14-15]。另外，TAM耐藥的機(jī)制也與一些信號(hào)通路有關(guān)，如HER2酪氨酸激酶信號(hào)通路、PI3K信號(hào)通路[5]。

在ER陽性乳腺癌患者中，雖然TAM治療已成為一線治療方案，但其發(fā)生耐藥的現(xiàn)象也越來越普遍。目前對(duì)于TAM耐藥乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制仍不清楚，因此TAM耐藥乳腺癌的治療不僅是目前臨床治療的難點(diǎn)，也是基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)。發(fā)掘TAM耐藥乳腺癌的新型治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，共挖掘出438個(gè)顯著差異基因，其中上調(diào)表達(dá)基因300個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因138個(gè)。對(duì)這些差異基因進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析示這些差異基因主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合及免疫應(yīng)答等功能，同時(shí)也參與MAPK信號(hào)通路和HIF-1信號(hào)通路等。利用生物信息學(xué)工具對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示蛋白間的相互作用主要集中在 MAPK1、ESR1、SMARCA4、RANBP2 和 PRKCA等節(jié)點(diǎn)基因。

MAPK1突變與多種癌癥相關(guān)，如乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌[16-18]。已有研究證明MAPK1超活化與TAM耐藥有關(guān)[19]，如活化的MAPK1通過促進(jìn)ERα（雌激素受體α）磷酸化使ERα的配體非依賴性轉(zhuǎn)錄增加，且過度活化的MAPK通過NF-κB依賴性途徑下調(diào)ERα的表達(dá)，從而引起TAM耐藥[20]。本研究結(jié)果顯示MAPK1位于PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，臨床中應(yīng)用MAPK1抑制劑聯(lián)合TAM治療ER陽性乳腺癌可能會(huì)提高患者的治療效果。

SMARCA4又稱為BRG1，是編碼SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物的核心蛋白。其控制許多細(xì)胞過程，如DNA修復(fù)、參與細(xì)胞周期等[21]。BRG1的表達(dá)與三陰性乳腺癌的增殖及預(yù)后相關(guān)，BRG1高表達(dá)者預(yù)后較差[22]。此外，有研究表明BRG1通過JNK1通路誘導(dǎo)在雌激素應(yīng)答啟動(dòng)子中聚集，參與雌激素拮抗劑介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞生長停滯的過程[23]。然而，關(guān)于BRG1與TAM耐藥的關(guān)系卻鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果表明SMARCA4基因在TAM耐藥乳腺癌中表達(dá)升高且在PPI網(wǎng)絡(luò)中屬于中心蛋白，顯示SMARCA4基因可能與TAM耐藥相關(guān)。因此對(duì)SMARCA4基因的進(jìn)一步研究可能為治療TAM耐藥的ER陽性乳腺癌找到新的潛在靶點(diǎn)。

ESR1是編碼雌激素受體α（ERα）的基因，屬于核受體家族的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，在內(nèi)分泌治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用[24]。研究表明ER表達(dá)下調(diào)或功能的喪失可能對(duì)TAM產(chǎn)生耐藥[25]。ER突變引起的配體非依賴性轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖并引起TAM耐藥[25]。本研究顯示ESR1在TAM耐藥樣本中表達(dá)下降，和KIM等[26]的報(bào)道相似，ESR1基因表達(dá)下降使TAM藥物缺乏結(jié)合靶點(diǎn)，導(dǎo)致部分ER陽性乳腺癌患者治療效果較差，成為臨床上的一大治療難點(diǎn)。進(jìn)一步對(duì)ESR1基因表達(dá)下調(diào)機(jī)制的研究，將有助于改善TAM耐藥乳腺癌的治療。PRKCA（蛋白激酶Cα）在不同的細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞增殖、凋亡及分化等[27]。Kim等[28]的研究表明PKC-α介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。另有研究顯示在TAM乳腺癌中PKC-α磷酸化水平顯著增加，PKC-α通過抑制c-Jun磷酸化來抑制ER-α的表達(dá)[26]。這些數(shù)據(jù)暗示PKC-α是TAM耐藥乳腺癌的潛在生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示PRKCA是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，以PRKCA為靶點(diǎn)治療TAM耐藥乳腺癌將有廣闊的臨床研究前景。

Ran結(jié)合蛋白2（RANBP2）是核漿-胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)因子[29]，編碼具有358-kDa的在有絲分裂等功能中起作用的核孔蛋白[30]。該基因與一些致瘤通路有關(guān)，例如間接參與P53和PI3K/Akt信號(hào)通路[31-32]。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活與TAM繼發(fā)性耐藥相關(guān)。RANBP2可能通過干擾PI3K/Akt信號(hào)通路引起乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM產(chǎn)生耐藥。目前關(guān)于RANBP2與TAM耐藥機(jī)制的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究顯示RANBP2在TAM耐藥乳腺癌中過度表達(dá)，RANBP2的過表達(dá)可能直接或間接參與TAM耐藥。進(jìn)一步加深RANBP2在TAM耐藥機(jī)制中的研究，為TAM耐藥的ER陽性乳腺癌尋找更多的治療選擇。

通過生物信息學(xué)分析差異基因的GO功能及富集通路主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合、poly（A）RNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)節(jié)、DNA模板化、細(xì)胞粘附的鈣粘蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、RIG-I樣受體信號(hào)傳導(dǎo)通路、HIF-1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等分子生物功能及信號(hào)通路。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）是腫瘤增殖及遷移等過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1信號(hào)通路已被證實(shí)與多種癌癥相關(guān)，如肝癌、結(jié)直腸癌等。HIF-1與MAPK/ERK通路相互作用，促進(jìn)腫瘤的生長及增殖。但尚未有關(guān)于HIF-1信號(hào)通路與TAM耐藥相關(guān)的研究和報(bào)道，進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究HIF-1信號(hào)通路的作用將有助于揭示ER陽性乳腺癌TAM耐藥機(jī)制。

利用生物信息學(xué)方法有效發(fā)掘差異表達(dá)基因的相互作用信息，通過對(duì)差異基因的功能及參與的信號(hào)通路進(jìn)一步研究，為TAM耐藥的ER陽性乳腺癌的早期診斷及治療靶點(diǎn)選擇提供了新的線索，也為后期繼續(xù)研究來驗(yàn)證這些潛在的治療方法提供了方向。