即時檢測芯片通道表面親水涂膜處理工藝*

李 霞， 劉 沖， 梁 超， 李經(jīng)民

(1.大連理工大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，遼寧 大連 116024;2.大連理工大學(xué) 遼寧省微納米技術(shù)及系統(tǒng)重點(diǎn)實驗室，遼寧 大連 116024)

0 引 言

即時檢測(point-of-care testing,POCT)技術(shù)是指臨近患者病床的一種病情快速檢測、分析的新興技術(shù)，而其核心技術(shù)就是微流控檢測芯片[1～3]。近些年，聚合物微流控芯片因為其制造成本低、高質(zhì)量的檢測表現(xiàn)、溶劑消耗低以及良好的生物兼容性在各個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[4,5]。一個典型的微流控即時檢測芯片通常包括進(jìn)樣單元、混合反應(yīng)單元、檢測通道網(wǎng)絡(luò)、廢液收集單元和一些液流控制閥[6～8]。在微流控檢測器件里，液體待檢測樣品流過通道網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)從而獲得檢測結(jié)果[9～11]。液流在即時檢測芯片通道網(wǎng)絡(luò)中前進(jìn)的驅(qū)動力一般是依靠毛細(xì)管通道本身的毛細(xì)力作為驅(qū)動力。但是超過通道結(jié)構(gòu)一定尺度，以聚合物作為基底材料的微流控芯片，只依靠其本身材料的表面張力并不足以驅(qū)動液流平穩(wěn)前進(jìn)，且在檢測液流過程中液體在通道中前進(jìn)的液體前端流動形狀不穩(wěn)定，嚴(yán)重會產(chǎn)生氣泡，更甚通道表面的驅(qū)動力不足會引起斷流現(xiàn)象。當(dāng)血樣進(jìn)行檢測時，血樣中的目標(biāo)配體與已經(jīng)事先與附著在混合反應(yīng)區(qū)域的檢測試劑發(fā)生反應(yīng)進(jìn)而得到響應(yīng)信號結(jié)果[12]。也就是指血樣中的抗原必須和抗體在檢測區(qū)發(fā)生特異性結(jié)合才可以產(chǎn)生響應(yīng)信號。然而不通暢平穩(wěn)的液體流動會影響后續(xù)的反應(yīng)和檢測工作，降低檢測效率和準(zhǔn)確性。除此之外在即時檢測芯片的批量生產(chǎn)中，片間流動的差異性也是需要控制在一定范圍之內(nèi)的[13]。規(guī)模化、批量化的微流控芯片表面改性處理尤其是針對即時檢測芯片正面臨著巨大挑戰(zhàn)。

用于微流體驅(qū)動的常見方法有壓力驅(qū)動[14]、電滲流驅(qū)動以及電水力驅(qū)動[14]等方法。其中壓力驅(qū)動是依靠入口與出口的壓力差驅(qū)動液流前進(jìn)，產(chǎn)生壓差的一般為微泵，而用于即時檢測的微流控芯片中如再加入微泵會極大地提高制造成本。另外電滲流與電水力驅(qū)動原理相似，都是利用電場作用使液體在管道或多孔介質(zhì)中流動，此方法無疑會時檢測步驟繁瑣，即時檢測也就失去了其快速檢測的意義。

本文的主要研究內(nèi)容是應(yīng)用增強(qiáng)材料表面張力的辦法，針對具體一種聚合物微流控即時檢測芯片的液流驅(qū)動展開研究。 具體方案為運(yùn)用自行設(shè)計優(yōu)化配比的二氧化鈦(TiO2)溶膠作為涂膜溶液，運(yùn)用一個半自動化的提拉機(jī)器，對即時檢測芯片進(jìn)行浸漬提拉涂膜工藝處理。親水涂膜后芯片通道的親水性大幅提高，樣液在通道中流動形狀穩(wěn)定，避免了氣泡產(chǎn)生的情況，提高了熒光檢測峰值，縮小流動速度的片內(nèi)與片間差異性。

1 實驗部分

1.1 材料與溶液準(zhǔn)備

實驗所用芯片結(jié)構(gòu)是在聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA，日本旭化成公司)經(jīng)熱壓工藝制作的，PMMA的玻璃花轉(zhuǎn)變溫度約為105 ℃。實驗所用主要試劑包括鈦酸四丁酯(tetrabutyl orthotitanate,TBOT,AR)、無水乙醇(ethyl alcohol,EtOH,GR)、硝酸(HNO3,AR)、乙酰丙酮(acetylacetone,AcAc,AR)、去離子水等。熱壓工藝后基片與蓋片均被浸沒在DZ—1清洗劑與去離子水按照1︰20的比例配制的溶液中，在超聲清洗機(jī)內(nèi)超聲清洗30 min，而后用清水超聲清洗30 min后干燥備用。實驗所用的人體血清由大連理工大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院提供。

1.2 芯片設(shè)計

實驗所用微流控芯片如圖1(a)所示，芯片整體由基片和蓋片兩部分組成。芯片大小為108 mm×20 mm×2 mm，芯片通道以及各控制反應(yīng)單元的微結(jié)構(gòu)均在基片上熱壓成型。基片結(jié)構(gòu)由進(jìn)樣區(qū)、混合區(qū)、時間閥、反應(yīng)通道以及廢液區(qū)組成。其中進(jìn)樣區(qū)內(nèi)放有濾紙過濾樣血；混合區(qū)域用于血樣中的抗原與熒光物質(zhì)結(jié)合；時間閥用于放慢液體流動速度，利于抗原與熒光物質(zhì)的充分結(jié)合；流動通道尺寸為寬2 mm，長60 mm，深70 mm，通道內(nèi)有微柱陣列增強(qiáng)表面張力，通道內(nèi)一段距離為熒光檢測區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)附著有抗體與血液中抗體結(jié)合進(jìn)而實現(xiàn)檢測。浸漬提拉專用提拉機(jī)器移動精度為1 μm，提拉裝置上下運(yùn)動實現(xiàn)浸漬提拉動作，如圖1(c)所示。

1.3 芯片制造

芯片微結(jié)構(gòu)運(yùn)用紫外光光刻(ultra violet-LIGA,UV-LIGA)技術(shù)制作在硅模具上，通過熱壓技術(shù)將微結(jié)構(gòu)熱壓到PMMA基片上。采用超聲焊接工藝將基片與蓋片實現(xiàn)焊接形成密閉通道?；臒釅撼尚凸に嚾缦拢哼\(yùn)用激光切割機(jī)將PMMA板切成芯片所需外形，將干凈的PMMA板放置到熱壓機(jī)(本實驗室自行設(shè)計制造，如圖1(b))的熱板上，將熱板以0.5 ℃/s的速度將溫度升至90 ℃保持2 min；將溫度以0.2 ℃/s的速度升至120 ℃，同時將熱壓頭下降至熱壓位置以0.02 MPa/s的速度加壓；當(dāng)溫度升至120 ℃，壓力升至2.0 MPa后，保持5 min；將基片降溫至40 ℃，同時壓力降至0.5 MPa；將溫度升至70 ℃進(jìn)行脫模操作。熱壓微結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示。超聲焊接過程比熱壓步驟簡單，超聲焊接機(jī)如圖1(d)所示，焊接壓力設(shè)定為0.2 MPa；焊接時間和保溫時間分別設(shè)置為0.01 s和5 s；芯片采用高頻超聲焊頭將基片與蓋片壓緊后加壓焊接，焊接工藝完成；準(zhǔn)備步驟結(jié)束后進(jìn)行熒光檢測，檢測儀器如圖1(e)所示。

圖1 實驗芯片及工藝所需設(shè)備

1.4 溶膠制備

實驗中，溶膠配制與已有TiO2溶膠成分類似，但基于大量的配比及實驗數(shù)據(jù)，優(yōu)化出了一個基于本文特定芯片具體檢測要求的配比及工藝方案。溶膠TBOT作為前驅(qū)體，無水乙醇為溶劑，硝酸為催化劑，AcAc作為絡(luò)合劑。通過水解鈦酸丁酯制備TiO2溶膠。經(jīng)一系列對比試驗，綜合實際檢測實驗需要，最終獲得優(yōu)化溶膠配制流程如下:

1)采用20 mL TBOT溶于90 mL無水乙醇，并用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌。同時，取AcAc 6 mL滴入溶液中，不斷攪拌30 min，形成1#溶液。

2)70 mL無水乙醇與4 mL去離子水混合并加入2 mL硝酸，形成2#溶液。

3)將2#溶液緩慢滴加入1#溶液中，后持續(xù)磁力攪拌器2 h，直至黃色溶膠的形成。

4)經(jīng)3～5天的密封避光陳化，溶膠即可用作浸涂液。

另外，溶膠配置完成后取潔凈的芯片基片，運(yùn)用浸漬提拉機(jī)器以2 mm/s的提拉速度緩慢提拉成膜，后將基片放入真空烘箱60 ℃干燥30 min。后超聲水浴5 min，干燥。如圖2所示涂膜前后接觸角對比，未經(jīng)處理的PMMA接觸角約為80°，處理后表面接觸角約為32°。液體流動實驗測錄是運(yùn)用體視顯微鏡(本實驗室自主研發(fā))。將人的血清滴入芯片進(jìn)樣口中，經(jīng)表面親水涂膜后的芯片通道中液體均勻流動且流動形狀穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)氣泡或斷流情況。最后用熒光檢測儀器檢測熒光強(qiáng)度，進(jìn)而檢測血樣中cTnI濃度。

圖2 親水涂膜片間差異性實驗結(jié)果(每片隨機(jī)取5個測量點(diǎn))

2 實驗與結(jié)果分析

2.1 實驗原理分析

液體在毛細(xì)管中流動時液體由毛細(xì)管內(nèi)的毛細(xì)力作為驅(qū)動力，液滴滴入芯片后，液流由毛細(xì)力驅(qū)動流至檢測區(qū)。Zimmermann M等人[15]研究了毛細(xì)管系統(tǒng)的液體流動特性,指出在毛細(xì)管中流體速度的變化符合下列理論

式中Q為流體速度，η為流體的粘度，ΔP為毛細(xì)管中的氣液差，RF為毛細(xì)管中的流動阻力?？芍越大Q越大，RF越小Q越小。

實驗芯片通道的橫截面呈矩形，在矩形毛細(xì)管系統(tǒng)中，氣液壓力符合以下理論

式中Pc為毛細(xì)管中氣液半月板壓差；γ為液體的表面張力；αb，αt，αl，αr分別為毛細(xì)通道上下左右4個面的接觸角；a，b分別為毛細(xì)通道矩形截面的長和寬。如上述理論所示，通道內(nèi)表面接觸角越小，毛細(xì)管壓力絕對值越大，微通道內(nèi)的液體流動速度越快?；诖?，可以減小通道內(nèi)表面的接觸角來加速通道內(nèi)液體流動。

另外，在TiO2溶膠和凝膠膜形成的制備過程中發(fā)生的反應(yīng)如圖3(a)所示，前軀體鈦酸丁酯發(fā)生水解和縮聚反應(yīng)最終形成穩(wěn)定凝膠膜。親水涂層工藝處理后由工具顯微鏡(STM6—F10—3型，OLYMPUS公司)拍攝的芯片表面微結(jié)構(gòu)如圖3(b)所示，通道表面微結(jié)構(gòu)處理前后并未有較大差異。如圖3(c) 所示，通過表面基團(tuán)紅外光譜分析，經(jīng)過親水涂膜的材料表面羥基峰升高，羥基含量上升，表面羥基含量的增加提高了材料表面的親水性，即表面接觸角變小，表面張力增大。

圖3 親水膜形成原理及親水膜表面研究

2.2 親水膜性能表征

運(yùn)用Zygo表面輪廓儀檢測涂層表面形貌，檢測表面形貌圖如圖4所示。

圖4 親水膜表面質(zhì)量表征

圖4(a)為空白對照表面，圖4(b) 為親水涂膜處理后表面，檢測結(jié)果顯示空白對照的表面粗糙度為0.017 μm，親水涂膜處理后表面粗糙度為0.010 μm，二者之間差別不大。芯片通道表面親水性增強(qiáng)的原因是表面羥基含量增高而不是表面粗糙度的原因。此外運(yùn)用臺階儀(ET4000M,KOSAKA,日本)測量當(dāng)提拉速度為2 mm/s，溫度為20 ℃的親水膜厚?；话虢?jīng)親水涂覆一半不處理，臺階儀探頭劃過兩個界面表面，選取兩個測量點(diǎn)取均值后測得平均膜厚約為234 nm。最后運(yùn)用DIN EN ISO 2409︰2007方法測試膜與基底表面的結(jié)合力，檢測結(jié)果如圖4(a)所示，脫落比例約為8 %，因此該親水膜與基底有很好的結(jié)合力。另外，如圖4(d)所示若表面處理后不經(jīng)過水浴處理會出現(xiàn)水滴痕跡，因此，在本文表面處理工藝中水浴處理不可或缺。

2.3 芯片流動性能表征

運(yùn)用體視顯微鏡觀察并記錄芯片為通道內(nèi)的液體流動情況，以研究其流動穩(wěn)定性。設(shè)置一組對照實驗，每組10個芯片，一組經(jīng)親水涂膜處理，一組作為空白對照，經(jīng)相同的處理工序?qū)⑿酒暫附雍?，觀察實驗結(jié)果。每個芯片注入150 μL血清，血清在芯片中流動過程由顯微鏡電荷耦合器件(charge coupled device,CCD)鏡頭拍下，檢測結(jié)果及數(shù)據(jù)分析如圖5。

在空白對照組中有6片芯片出現(xiàn)斷流情況，其余未斷流的芯片流動時間過長或出現(xiàn)不規(guī)則流動形狀進(jìn)而產(chǎn)生氣泡極大影響檢測。而經(jīng)過親水涂層處理的芯片則流速平穩(wěn)且流速控制在可用速度范圍內(nèi)，如圖5 (a)所示。為研究液體在不同芯片同一個功能區(qū)域內(nèi)的流動速度與穩(wěn)定性，將芯片主通道分為7個部分分別研究了其流動速度，結(jié)果如圖5(b)所示，在每個區(qū)域內(nèi)不同片間的速度標(biāo)準(zhǔn)差均不超過15 %。另外處理后液體在微通道中流動形狀穩(wěn)定，與未處理芯片流動形狀對比如圖5(c)和5(d)所示，處理過的芯片液體流動呈現(xiàn)穩(wěn)定凸液面。

圖5 親水涂膜后芯片流動性檢測

2.4 熒光配體檢測

本實驗即時檢測芯片用于檢測心肌梗死的一個生物標(biāo)志物cTnI。熒光檢測之前，混合區(qū)域附著有水溶性熒光物質(zhì)，檢測區(qū)域附著有抗體。血清進(jìn)入通道時，樣品與混合區(qū)中水溶性熒光物質(zhì)混合，血清中cTnI與熒光物質(zhì)結(jié)合。隨后，血清將流入檢測通道并與通道內(nèi)的抗體反應(yīng)，運(yùn)用熒光檢測技術(shù)，通過熒光強(qiáng)度進(jìn)而判斷血清中cTnI含量。檢測結(jié)果如圖6所示，經(jīng)表面親水處理的芯片檢測結(jié)果熒光峰值均超過熒光檢測強(qiáng)度的允許下限，基線值約為5 000～8 000，且峰值差穩(wěn)定在50 000以內(nèi)，均為單峰，檢測曲線形狀較穩(wěn)定。

圖6 芯片cTnI熒光檢測結(jié)果

3 結(jié) 論

經(jīng)研究表明:溶膠—凝膠涂層可以增加毛細(xì)管對液體的驅(qū)動力，涂膜前后材料的接觸角分別為80°和32°。另外親水浸漬提拉涂膜厚度為234 nm達(dá)到納米級別，遠(yuǎn)小于通道結(jié)構(gòu)尺寸，因此涂層不會影響通道原有微結(jié)構(gòu)，且成膜質(zhì)量良好，與基底粘附性好。且親水涂層改性后，液體在微通道內(nèi)流動性能得到提高。最后親水涂層工藝可以顯著提高cTnI熒光檢測峰值，峰值穩(wěn)定不會出現(xiàn)多峰情況。