蘆丁對梗阻性腎病大鼠腎臟氧化應激損傷及Nrf2/HO-1通路的影響

王 斌，趙 明，陳志勇，賴永通，郭雪坤，黃先恩，趙國志，蔡瑞明，林民專△

(1.廣州醫科大學附屬第三醫院器官移植科,廣州 510150；2.南方醫科大學珠江醫院器官移植科,廣州 510282)

梗阻性腎病可造成腎小管間質纖維化和腎臟結構改變，嚴重者可導致腎臟功能喪失，是兒童及成人終末期腎衰竭的常見原因。單側輸尿管梗阻(unilateral urethral obstruction，UUO)是目前最常用的腎臟損傷動物模型之一。它可以模擬慢性梗阻性腎病的病理發展過程，如氧化應激、炎性反應、膠原成分的異常沉積和腎間質纖維化等。近年來，大量研究證實氧化應激與多種腎臟病的發生、發展密切相關，針對氧化應激及抗氧化機制進行腎臟病防治已成為國內外諸多學者共同關注的焦點[1-2]。核因子E2相關因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)是內源性抗氧化機制中的關鍵因子，通過激活Nrf2，可進一步誘導血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)等下游信號分子的表達，從而發揮抗氧化應激作用[3]。

蘆丁是生物黃酮素家族成員之一，它具有抗氧化、抗炎癥、抗過敏、抗病毒、抗癌等廣泛的藥理作用[4-5]。在前期的實驗研究中，本課題組已證實蘆丁能有效改善UUO大鼠腎臟炎癥及纖維化。此外，國內外研究表明，蘆丁對缺血再灌注腎損傷[6]、糖尿病腎病[7]、藥物性腎損害[8]等具有顯著的保護作用，均與抗氧化應激有關。然而，蘆丁對于梗阻性腎病的氧化應激損傷的作用情況及機制尚不清楚。本研究擬通過觀察蘆丁對UUO大鼠腎臟氧化應激損傷的影響，進一步探討蘆丁對腎臟保護作用的機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性Wiastar大鼠24只，體質量200～250 g，購于南方醫科大學動物實驗中心[SCXK(粵)2011-0015]。

1.2試劑 蘆丁水合物(濃度大于或等于94%)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自美國Sigma公司，兔抗大鼠HO-1單克隆抗體、兔抗大鼠Nrf2單克隆抗體購自美國Abcam公司，丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，免疫組織化學試劑盒(批號：PV-9000)、二甲基鄰苯二胺(DAB)顯色試劑(批號：ZLI-9018)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1動物分組及UUO模型制備 將24只Wiastar大鼠分為4組：假手術組、蘆丁治療假手術組、模型組、蘆丁治療模型組，每組6只。模型組和蘆丁治療模型組大鼠經5%戊巴比妥鈉溶液(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，經腹部正中切口逐層打開腹腔,暴露并鈍性分離左側輸尿管，分別在左側髂動脈處及近腎盂處用4-0線結扎左側輸尿管，并于兩線結之間剪斷輸尿管，最后逐層縫合并關閉腹腔。假手術組和蘆丁治療假手術組大鼠僅分離左側輸尿管但不行結扎，其余手術步驟與模型組大鼠相同。術后24 h，蘆丁治療假手術組和蘆丁治療模型組大鼠給予蘆丁(100 mg·kg-1·d-1溶于1% CMC-Na溶液)灌胃，其余兩組大鼠給予等體積1% CMC-Na溶液灌胃。

1.3.2標本采集及處理 各組大鼠均于術后第14天處死。留取左側腎臟，部分腎組織用4%多聚甲醛進行固定，用于蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學檢測，其余腎組織置于-80 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3腎組織病理學檢查 取4%多聚甲醛固定后的左腎組織，常規行脫水、透明、包埋，切成4 μm厚的切片，行HE染色，每張切片在光學顯微鏡(×200)下采集10個不重復視野。根據文獻[9]的方法，采用腎小管擴張、小管萎縮、小管細胞空泡形成、蛋白管型、紅細胞管型、間質炎性細胞浸潤、間質纖維化和間質水腫共8項病變指標，每項指標評分為0～3分：正常0分，輕度1分，中度2分，重度3分。對每張HE染色切片進行腎間質損傷評分，最后統計并取平均值作半定量分析。

1.3.4腎組織MDA水平及SOD、GSH-PX活性的測定 運用考馬斯亮藍法測定勻漿液蛋白質水平后，參照南京建成生物公司試劑盒提供的檢測方法進行操作，分別測定腎組織勻漿液的MDA水平及SOD、GSH-PX活性。

1.3.5免疫組織化學染色法檢測HO-1 石蠟切片常規脫蠟至水，用0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)進行抗原微波修復。冷卻至室溫后，用3% H2O2孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶活性。滴加抗HO-1抗體(1∶200)孵育，4 ℃過夜后，37 ℃孵育1 h，滴加二抗，37 ℃孵育20 min，DAB顯色，鏡下觀察；HE復染，自來水沖洗后1%鹽酸乙醇分化，常規脫水透明，中性樹膠封片。每張切片在光學顯微鏡下(×200)采集腎間質區域10個不重復視野，并用Image-Pro Plus6.0軟件分別計算每個視野下的陽性區域面積，并取平均值作半定量分析。

1.3.6Western blot檢測Nrf2和HO-1蛋白的表達 取-80 ℃保存的腎組織，按分子克隆實驗指南的方法對腎組織進行勻漿、裂解，分別抽提核蛋白和總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。吸取等量蛋白樣品(50 μg)，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，再依次經5%脫脂牛奶封閉、加入一抗(Nrf2、HO-1，均按1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜、加入二抗室溫孵育1 h后，用ECL化學發光法顯影，最后采用Image J軟件對各條帶進行半定量分析。

2 結 果

2.1各組大鼠腎臟組織病理學表現 HE染色顯示，假手術組及蘆丁治療假手術組腎小管及腎小球大小、形態均未見異常，間質無增寬及水腫，無炎性細胞浸潤。模型組可見腎小管擴張，小管上皮細胞變性、腫脹、壞死及脫落，小管萎縮，腎間質明顯增寬，腎間質大量炎性細胞浸潤。蘆丁治療模型組腎小管損傷、炎性細胞浸潤較模型組減輕。腎間質損傷評分顯示：與假手術組比較，模型組腎間質損傷明顯加重(P<0.05)；與模型組比較，蘆丁治療模型組腎間質損傷明顯減輕(P<0.05)，見圖1。

2.2各組大鼠腎臟MDA水平及SOD、GSH-PX活性變化 與假手術組比較，模型組腎組織中MDA水平明顯升高，SOD和GSH-PX活性明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，蘆丁治療模型組腎組織中MDA水平明顯降低，SOD和GSH-PX活性明顯升高(P<0.05)，見圖2。

2.3各組大鼠腎臟Nrf2、HO-1的表達 免疫組織化學染色圖片及半定量分析結果顯示，HO-1蛋白主要見于腎小管上皮細胞，在假手術組腎臟組織中有少量表達。與假手術組比較，模型組腎臟HO-1蛋白表達明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，蘆丁治療模型組腎臟HO-1蛋白表達進一步增加(P<0.05)。Western blot免疫印記條帶及半定量分析結果顯示，假手術組腎臟組織Nrf2、HO-1蛋白均有少量表達。與假手術組比較，模型組Nrf2、HO-1蛋白表達均明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，蘆丁治療模型組Nrf2、HO-1蛋白表達進一步增加(P<0.05)，見圖3。

A:腎組織HE染色(×200)；B：間質損傷評分;a:P<0.05，與假手術組比較;b:P<0.05，與模型組比較

圖1各組大鼠腎臟病理學表現

A：MDA水平；B:SOD活性；C：GSH-Px活性;a:P<0.05，與假手術組比較;b:P<0.05，與模型組比較

圖2各組大鼠腎臟MDA水平及SOD、GSH-Px活性情況

A：腎組織免疫組織化學染色(×200)；B：Western blot蛋白條帶；C:HO-1陽性面積百分比；D:Nrf2蛋白相對表達水平；E:HO-1蛋白相對表達水平；a:P<0.05，與假手術組比較;b:P<0.05，與模型組比較

圖3各組大鼠腎臟Nrf2、HO-1的表達情況

3 討 論

梗阻性腎病的發病機制十分復雜，而由其所致的腎臟血流動力學改變、缺血缺氧和代謝紊亂，可進一步引起氧化應激損傷、炎性細胞浸潤、腎小管損傷、細胞增殖及轉分化、膠原成分沉積等一系列病理變化，嚴重者可出現腎臟纖維化甚至腎衰竭。近年有研究發現，氧化應激反應在梗阻性腎病、糖尿病腎病、腎缺血再灌注損傷、藥物性腎損害等急、慢性腎臟病的病理過程中扮演重要角色[10-11]。

UUO是目前建立梗阻性腎病最常用的動物實驗模型。本研究采用該模型建立大鼠梗阻性腎病，與既往研究一致[9]，本課題組通過HE染色觀察到模型組大鼠梗阻腎臟出現顯著的病理損傷，主要表現為腎小管擴張或萎縮、小管細胞空泡變性、炎性細胞浸潤、間質水腫增寬和纖維化等。與模型組比較，蘆丁治療模型組大鼠腎臟的病理損傷明顯減輕，這表明蘆丁對梗阻性腎病具有保護作用。

氧化應激是指在各種刺激因素的作用下，機體內活性氧(reactive oxygen species，ROS)過度產生與抗氧化防御機制失衡的一種反應狀態，通常表現為大量ROS的產生，以及SOD、GSH-Px等抗氧化酶的減少。UUO可造成腎組織缺血、缺氧，進而導致大量ROS產生[12]。ROS可通過脂質過氧化，促使DNA分解，進而造成腎間質損傷。MDA是組織發生氧化應激反應后的一種脂質過氧化產物，其水平可反映組織細胞氧化應激損傷的嚴重程度[13]。SOD和GSH-Px是體內關鍵的抗氧化酶，它們在清除ROS的過程中發揮重要作用[14]。本研究觀察到，與假手術組比較，模型組大鼠MDA水平明顯增加，SOD和GSH-Px活性明顯降低，表明UUO大鼠梗阻腎臟發生氧化應激損傷，同時抗氧化能力受損。與模型組比較，蘆丁治療模型組MDA水平明顯減少，SOD和GSH-Px活性明顯升高，表明蘆丁具有抗氧化應激損傷作用。國外研究也證實，在糖尿病腎病[7]、腎缺血再灌注損傷[6]、膽管梗阻性肝損害[15]等動物實驗中，蘆丁能減少MDA水平，增強SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性，從而減輕氧化應激損傷。

Nrf2是參與調節機體天然抗氧化應激防御系統的主要調控因子。在機體正常生理條件下，Nrf2主要與Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)結合，并以無活性狀態存在于細胞質中。當出現氧化應激等刺激時，Nrf2與Keap1解離并遷移至細胞核內與ARE結合，調控多種抗氧化酶及解毒酶如過氧化氫酶、SOD、HO-1、GSH-Px、NAD(P)H:醌氧化還原酶-1[NAD(P)H:quinine oxidoreductase-1，NQO-1]等靶基因的轉錄，從而發揮其抗氧化應激等作用[16-17]。越來越多的研究表明，Nrf2在許多腎臟疾病中具有腎臟保護作用[18-20]。其中，以Nrf2信號通路為靶點進行干預在UUO所致梗阻性腎病中取得了的良好的腎臟保護效應[21-22]。KONG等[23]研究發現，Nrf2-/-大鼠UUO后腎臟損傷較Nrf2+/+大鼠明顯加重，此外，UUO本身可誘導正常大鼠梗阻腎臟Nrf2信號通路的激活。與該研究一致，本研究中筆者觀察到模型組大鼠梗阻腎臟細胞Nrf2、HO-1的表達較假手術組均明顯上調。此外，本研究發現，與模型組大鼠比較，蘆丁治療模型組大鼠Nrf2、HO-1的表達進一步上調，表明蘆丁的腎臟保護作用可能與增強Nrf2信號通路轉導有關。已有研究證實，蘆丁在膽管梗阻性肝損害[15]、糖尿病性神經病變[24]、四氯化碳毒性肝損害[25]等具有保護作用，其作用機制均與調控Nrf2/HO-1通路有關。

綜上所述，蘆丁可減輕梗阻性腎病大鼠腎臟氧化應激損傷，其治療作用可能是介導Nrf2/HO-1信號通路實現。同時，本研究揭示了Nrf2/HO-1信號通路在梗阻性腎病中的保護作用，為發掘梗阻性腎病治療靶點提供了新的思路。