miR-34a對乳腺癌細胞增殖與侵襲的影響

馮 剛,李良平,樊友本,劉志蘇

(1.三峽大學附屬第一臨床醫學院/宜昌市中心人民醫院甲乳外科,湖北宜昌 443000;2.上海交通大學附屬第六人民醫院普通外科,上海 200000;3.武漢大學中南醫院普通外科,武漢 430000)

乳腺癌是目前女性最為高發的惡性腫瘤之一，近年來，隨著現代分子診斷技術的發展，乳腺癌的早期診斷和治療已取得了實質性的進展，但乳腺癌的難治率和復發率仍然是急需解決的問題[1-2]。因此，尋找新的可行的乳腺癌診治方法一直是乳腺癌研究的重點和熱點。微小RNA(miRNA，miR)可通過堿基互補配對原則與特異性靶基因的3′UTR配對，從而發揮對靶基因的調節作用，此外miR可通過轉錄調控基因的表達，即對某些mRNA產生降解作用從而抑制蛋白質的合成，多項研究表明細胞的增殖凋亡與miR-34a相關[3-5]，miR-34a作為調控網絡中的重要分子涉及腫瘤的發生、發展，但目前關于乳腺癌的相關報道較少，本文檢測了miR-34a在各種乳腺癌細胞株中的水平，并將miR-34a模擬物和抑制劑轉染到乳腺癌細胞株中，觀察其細胞生物學行為變化，通過生物信息學預測并證實其作用機制，以期為乳腺癌的診斷及靶向治療提供新方向，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7、T47D、SK-BR-3和人乳腺上皮細胞MCF-10A均購于武漢大學基礎醫學院,熒光報告載體(pLUC)購于美國Promega公司。

1.1.2儀器和試劑 低溫高速離心機(Thermo Fisher公司，美國)；二氧化碳培養箱(Thermo Fisher公司，美國)；低溫高速離心機(Thermo Fisher公司，美國)；實時熒光定量(RT-PCR)儀(Stratagene公司，美國)；Transwell小室(Corning公司，美國)；ODYSSEY雙色紅外成像系統(LI-COR公司，美國)；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(北京天根生物公司，中國)；苯甲基磺酰氟(PMSF，Sigma公司，美國)；Trizol(Invitrogen公司，美國)；焦碳酸二乙酯(DEPC，Bio Basic公司，美國)；胎牛血清(Gibco公司，美國)；TBST緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，中國)；TBS緩沖液(北京索萊寶科技有限公司，中國)；牛血清清蛋白(Sigma公司，美國)；Lipofectamine2000(Invitrogen 公司，美國)；雙熒光酶報告系統檢測試劑盒(Promega公司，美國)；miR-34a模擬物(Invitrogen公司，美國)；miR-34a抑制劑(Invitrogen公司，美國)；TaqMan?Micro RNA反轉錄試劑盒(Life Technologies公司，美國)；TaqMan?Univsersal PCR Master MixⅡ(Life Technologies公司，美國)；TaqMan?Micro RNA分析試劑盒(Life Technologies公司，美國)；Wnt1兔抗人多克隆抗體(Proteintech公司，美國)；β-catenin兔抗人多克隆抗體(Proteintech公司，美國)；CyclinD1兔抗人多克隆抗體(Proteintech公司，美國)；熒光報告系統檢測儀(Promega公司，美國)；CCK8試劑盒(上海碧云天生物技術公司，中國)。

1.2方法

1.2.1細胞轉染 以3×105～4×105個/孔的量取對數期生長細胞鋪于6孔板中，用無抗生素培養基培養。轉染前細胞融合度應達到50%～60%。無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次除去殘余血清。每孔加入無血清DMEM/F12培養基1.5 mL。5 μL Lipofectamine2000加入250 μL無血清培養液中，移液器混勻，室溫放置5 min。5 μL miR-34a模擬物、抑制劑或其陰性對照加入250 μL無血清培養基中混勻，室溫放置5 min。將上述兩種液體混合，混勻室溫放置20 min。500 μL混合液加入每孔細胞，搖勻后放于37 ℃，5% CO2環境中培養。轉染6～8 h后更換含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，細胞繼續培養48 h后行后續實驗。

1.2.2RNA提取及RT-PCR 去培養基后直接加入Trizol，反復吹打裂解細胞，收集Trizol至離心管中，室溫放置上述樣品液10 min，每毫升Trizol中加入氯仿200 μL，劇烈振蕩1 min，室溫靜置5 min，12 000 r/min 4 ℃冷凍離心15 min，取出樣品吸取上清液約450 μL至含有600 μL冷凍異丙醇的新離心管中，混勻，12 000 r/min 4 ℃冷凍離心10 min去上清液，加入500 μL冷凍的75%乙醇，彈起沉淀后12 000 r/min 4 ℃冷凍離心5 min，去上清液。風干5～10 min加入DEPC約30 μL，-80 ℃保存。分光光度計Nanodrop上測定RNA濃度，反轉錄具體操作步驟按照TaqMan?Micro RNA反轉錄試劑盒說明書進行。按照16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min反應條件進行反轉錄，將得到的產物保存于4 ℃。冰上配制反應體系并加入8聯排PCR管中。按照95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環；72 ℃ 10 min反應條件進行反應。miR-34a正向引物：5′-GGG TGG CAG TGT CTT AGC T-3′，反向引物：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；內參U6正向引物：5′-GCG CGT CGT GAA GCG TTC-3′,反向引物：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。每個實驗重復3次，結果以2-△△CT法計算，用相對定量表示。

1.2.3CCK-8法 收集轉染后的各組細胞，將細胞制成密度為2×104個/mL的單細胞懸液。在96孔板中接種單細胞懸液(100 mL/孔)，將培養板放于37 ℃孵箱進行培養，每組設5復孔，以只加入培養基的培養孔為空白孔，培養24、48、72、96、120 h后分別向各孔中加入CCK-8溶液10 μL，將培養板放入37 ℃孵箱中繼續培養2 h。用酶標儀檢測各組細胞吸光度(OD450 nm)。

1.2.4Transwell實驗 根據公司操作說明書，將小室放入培養板中，在上室加入300 μL預溫的無血清培養基，室溫下靜置15～30 min，使基質膠水化，再吸去剩余培養液，制備細胞懸液，制備細胞懸液前讓細胞在無血清條件下饑餓12～24 h，消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，用PBS洗1～2遍，用含牛血清清蛋白的無血清培養基重懸。取細胞懸液100～200 μL加入Transwell小室上室中，加入500 μL含胎牛血清的培養基于下室，常規培養12～48 h后直接計數。

1.2.5雙熒光素酶實驗 將報告基因質粒與miR-34a模擬物共轉染MCF-7細胞中，48 h后收取細胞，吸除培養基，用1×PBS輕柔洗2遍，加入1×被動裂解液(PLB)反應液80～10 μL，每3～5分鐘搖晃1次，室溫放置15 min；將裂解液轉移至無菌小管，120 r/min離心30 s，取上清液轉移至新的無菌小管。將40 μL LARⅡ加入一次性測量管中，將10 μL細胞裂解液加入其中，混勻，放入熒光儀開始測量，記錄螢火蟲熒光素酶讀數，加入40 μL Stop&GloReagent，混勻，放入熒光儀開始測量，記錄內參海腎熒光素酶讀數，繼續測量其他樣品，計算兩種熒光素酶讀數的比值，取3個平行孔的平均值，并計算標準差。

1.2.6Western blot實驗 將收集的細胞中加入適量RIPA裂解液，放置冰上30 min。期間每10 min超聲破碎1次。4 ℃條件下，12 500 r/min離心10 min。取上清液，以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，分裝保存。接通電源，直至溴酚藍電泳至分離膠底部，切斷電源，取出凝膠，按照蛋白Marker指示切下所需部分，開啟電源，4 ℃條件下轉膜1.5 h后切斷電源。轉膜后聚偏氟乙烯(PVDF)膜浸入5%脫脂牛奶中，置搖床上室溫封閉2 h，以稀釋好的抗體Wnt1、β-catenin、CyclinD1、GAPDH孵育封閉后的PVDF膜，4 ℃過夜。將膜取出，TBST清洗3次，每次10 min，稀釋后的熒光二抗工作液37 ℃孵育40 min。TBS再次清洗3次，每次10～15 min。ODYSSEY雙色紅外成像系統掃描成像并計算灰度值。

2 結 果

2.1miR-34a在乳腺癌細胞中的表達水平 取正常乳腺上皮細胞MCF-10A中miR-34a的表達量為1，得出乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7、T47D、SK-BR-3中miR-34a的相對表達水平，可見miR-34a在多個乳腺癌細胞系中水平均顯著下調(t=5.34,t=3.75,t=6.23，t=6.91,P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與MCF-10A比較

圖1 miR-34a在正常乳腺上皮細胞和不同乳腺癌細胞株中的表達水平

2.2miR-34a對乳腺癌細胞增殖活性的影響 分別將miR-34a模擬物及抑制劑轉染入MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞中，采用RT-PCR檢測不同組中miR-34a的表達水平，結果顯示，miR-34a抑制劑組中miR-34a的表達水平顯著降低，而miR-34a模擬物組中miR-34a的表達水平顯著升高。根據CCK-8法檢測結果繪制乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的生長曲線，miR-34a模擬物組細胞活力顯著低于對照組，差異有統計學意義(t=10.26，P<0.05)，而miR-34a 抑制劑組細胞活力顯著高于對照組，差異有統計學意義(t=7.26，P<0.05)，見圖2。

2.3miR-34a對乳腺癌細胞侵襲能力的影響 兩種乳腺癌細胞在培養72 h后，乳腺癌細胞的侵襲能力均顯著降低，在MCF-7細胞系中，miR-34a模擬物組穿過小室的數目與對照組比較，差異有統計學意義(t=12.82，P<0.01)；在MDA-MB-231細胞系中，miR-34a模擬物組穿過小室的數目與對照組比較，差異也有統計學意義(t=9.35，P<0.05)，見圖3。

2.4雙熒光素酶實驗驗證miR-34a對Wnt1蛋白的直接靶向作用 通過靶基因預測網站TargetScan(http://www.targetscan.org/)和miRanda(http://www.microrna.org/)進行了生物信息學預測，結果顯示miR-34a與Wnt1 mRNA的3′UTR之間存在互補配對序列。WT組、Mut組和對照組質粒共轉染MCF-7細胞48 h后進行雙熒光素酶檢測，結果表明共轉染miR-34a模擬物和pLUC-Wnt1-WT-3′UTR的乳腺癌細胞中熒光素酶活性強度顯著低于其他組(t=11.28，P<0.01)，見圖4。

A：MCF-7細胞被轉染后miR-34a表達水平；B：MCF-7細胞不同轉染組生長曲線；C：MDA-MB-231細胞被轉染后miR-34a表達水平；D：MDA-MB-231細胞不同轉染組生長曲線；a：P<0.05，與對照組比較

圖2不同乳腺癌細胞被轉染后miR-34a相對表達水平及生長曲線圖

a：P<0.05，與對照組比較

圖3 miR-34a對乳腺癌細胞侵襲能力的影響

a：P<0.05，與對照組比較

圖4兩組Wnt1-3′UTR雙熒光素酶檢測對比

2.5miR-34a對Wnt1蛋白表達的影響 細胞轉染24 h后通過Western blot檢測分別轉染miR-34a模擬物和miR-34a抑制劑的乳腺癌細胞MCF-7中Wnt1蛋白的表達情況，結果顯示，經轉染后miR-34a模擬物組Wnt1的相對表達水平下調，與對照組比較差異有統計學意義(t=11.32，P<0.01)，miR-34a抑制劑組Wnt1相對表達水平上調，與對照組比較差異有統計學意義(t=4.85，P<0.05),見圖5。

A：轉染MCF-7細胞后各組Wnt1蛋白的Western blot；B：轉染MCF-7細胞后各組Wnt1蛋白相對表達水平；a：P<0.05，與對照組比較

圖5 miR-34a對乳腺癌細胞Wnt1蛋白表達的影響

圖6 miR-34a模擬物組及對照組β-catenin、CyclinD1蛋白的表達情況

A:轉染24 h后的各組蛋白相對表達水平；B:轉染48 h后的各組蛋白相對表達水平;a:P<0.05，與對照組比較

圖7 miR-34a模擬物組及對照組β-catenin和CyclinD1蛋白的相對表達水平

2.6miR-34a對β-catenin和CyclinD1蛋白的影響 Western blot檢測miR-34a模擬物組轉染24和48 h后β-catenin和CyclinD1蛋白的表達，結果顯示，miR-34a模擬物轉染24 h后β-catenin和CyclinD1蛋白的表達顯著下降，48 h后β-catenin和CyclinD1蛋白的表達仍顯著下降，與對照組比較，差異均有統計學意義(t=10.25，t=11.36，P<0.05；t=13.57，t=12.24，P<0.05)，見圖6、7。

3 討 論

miR是一種長度約為22 NT的非編碼miR，目前已有許多研究證實miR與疾病的發生、發展具有非常密切的關系[6-9]，通過與正常表達譜進行比較，發現miR參與了惡性腫瘤與其他眾多慢性疾病的發生，并對這些疾病的生理、病理過程產生顯著的調控作用，如調控細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移等，且還會影響這些疾病的轉歸及預后，甚至會顯著影響患者的生存期[10-11]。miR-34a是miR家族中的一員，研究發現，多種腫瘤細胞的周期、衰老、凋亡都與miR-34a有著直接的關聯[12-13]。還有研究表明，miR-34a在胃癌[14-15]、腦膠質瘤[16]、肝癌[17-18]和結直腸癌[19-20]中表達水平顯著下調，且表現出組織依賴性，即不同的癌組織中miR-34a表達下調程度不同[21]。

Wnt信號通路在惡性腫瘤中具有重要作用，其機制為影響腫瘤細胞增殖、分化、凋亡、細胞周期、細胞黏附能力及血管再生[22]。目前認為，Wnt通路致癌關鍵是β-catenin降解障礙致使細胞質內游離β-catenin聚集并與Tcf/Lef結合進入細胞核，從而激活下游靶基因CyclinD1、C-myc的轉錄，導致腫瘤的發生[23-24]。CyclinD1是調節細胞進入增生期的主要因子，已被證實為原癌基因，其過度表達和失調控均可導致細胞周期調控異常從而發生腫瘤，乳腺癌組織中存在著異常Wnt通路，其多個成員均參與乳腺癌的發生、發展，β-catenin的異常表達可能通過促使或激活CyclinD1的過表達導致乳腺癌的發生、發展。已有研究證明miR-100、miR-1和miR-142通過抑制或增強Wnt信號通路促進乳腺癌發生、發展[25-27]。

本研究結果表明在過表達miR-34a的情況下，乳腺癌細胞的增殖、侵襲能力受到明顯抑制，而抑制乳腺癌細胞中miR-34a的表達，乳腺癌細胞的增殖、侵襲能力則明顯增加。進一步的機制研究中，證明了miR-34a的直接靶基因是Wnt1蛋白，過表達miR-34a能顯著抑制Wnt1的表達，同時也影響了Wnt信號通路的下游關鍵基因β-catenin、CyclinD1的表達，從而影響乳腺癌細胞的生物學行為，即乳腺癌細胞增殖、侵襲能力受到抑制的原因是由于miR-34a通過直接靶向Wnt1基因，從而影響其下游基因的表達，誘導乳腺癌細胞產生上述細胞學行為，在體外實驗中，乳腺癌細胞侵襲能力和增殖能力發生顯著改變，提示乳腺癌的發生、發展與miR-34a表達水平密切相關，miR-34a表達水平的檢測可以作為乳腺癌診斷的參考指標，對于臨床上乳腺癌早期診斷和早期治療提供了新的思路和方向。