當歸紅芪超濾物對順鉑誘導大鼠腎足細胞損傷的保護作用研究

李竺娟,寇 煒△,朱琳菊,孫少伯,馬桂蘭

(1.西北民族大學醫學院，蘭州 730030；2.甘肅中醫藥大學中西醫結合系，蘭州 730000)

作為常規化療藥物的順鉑在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常細胞及免疫系統也會產生不良反應，其中腎毒性為其主要的不良反應[1]。許多研究證實一些中藥成分發揮著提高機體免疫、保護細胞的作用，因此，推測當歸、紅芪等中藥材某些成分可能對機體細胞起到一定保護作用。在腫瘤化療過程中輔以當歸紅芪超濾物(RAS-RH)以達到對化療藥物產生減毒的效果，以保護正常細胞。本實驗借助大鼠腎足細胞，采用順鉑常規化療，輔以超濾技術提取純化的RAS-RH干預，闡明RAS-RH通過調控腎足細胞凋亡的作用減輕腎毒性，為當歸、紅芪抗腫瘤的臨床應用提供一定的實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 大鼠腎足細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所，經甘肅中醫藥大學中西醫結合實驗室傳代培養。

1.1.2藥物 中藥紅芪、當歸均采自甘肅省岷縣，經甘肅中醫藥大學藥學院生藥學教研室鑒定：紅芪是豆科巖黃芪屬植物多序黃芪的干燥根莖，當歸為傘形科植物的干燥根，RAS-RH參照本研究小組前期制作流程和結果，由甘肅中醫藥大學科研實驗中心與甘肅省膜科學研究院聯合制備。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察不同分組腎足細胞的生長的代表圖

1.1.3試劑及儀器 倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)；Thermo 311 CO2培養箱(美國Thermo公司)；電動離心機(金壇市恒豐儀器廠)；SCS-24搖床(上海市離心機械研究所)；精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；高糖培養基、0.5%胰蛋白酶、TrizonX-100、胎牛血清、100×青霉素-鏈霉素溶液均為美國HyClone公司產品；超凈工作臺、流式細胞儀、E-Plate 16孔細胞檢測板、xCELLigence RTCA實時細胞功能分析儀(艾森生物-杭州有限公司)；順鉑(6J014A89)上海譜振生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1RAS-RH的制備 當歸、紅芪飲片以1∶5的比例混合，水煎煮兩次，過濾水煎液并加熱濃縮后，陶瓷膜微濾濃縮液(技術參數為壓力0.2 mPa/m3、溫度25 ℃，流量10 L·h-1·m-2)，選用截留相對分子量為1×105PNA中空纖維超濾膜，超濾經微濾處理后的當歸、紅芪水煎劑濃縮液(技術參數：壓力5～6 kg/m3、溫度25 ℃，流量10 L·h-1·m-2)，將超濾液噴霧干燥成粉，相對生藥材的得率為0.9%[2]。

1.2.2細胞分組及處理 將大鼠腎足細胞分成4組：對照組、藥物組、順鉑組及聯合組。順鉑組一次性給順鉑4 μg/mL處理24 h，藥物組給予RAS-RH 10 μg/mL培養24 h，聯合組先給予RAS-RH 10 μg/mL培養24 h，再一次性給予順鉑4 μg/mL處理。

1.2.3RTCA實時細胞分析 檢測板前4孔加入150 μL高糖培養基，后4孔加入150 μL RAS-RH，放入RTCA Station中測定基線，保證每孔接觸正常并且細胞指數在正常值之內。取制備好的大鼠腎足細胞懸液，分別以每孔4×103個接種于檢測板E-Plate 16中，在超凈臺中靜置30 min后，置于培養箱中的RTCA工作站中，每隔15 min記錄細胞指數，總時長96 h。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 0.25%胰酶消化收集各組細胞，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，在染色緩沖液中5×105個/mL重懸細胞，吸取100 μL細胞(1×105)至試管中，加入5 μL熒光標記的膜聯蛋白V(Annexin V)試劑和3 μL碘化丙啶(PI)，混勻后避光室溫孵育15 min，孵育后加入400 μL染色緩沖液，流式細胞儀檢測。

2 結 果

2.1順鉑對大鼠腎足細胞增殖的抑制作用 順鉑組腎足細胞經過順鉑4 μg/mL處理 24 h后，細胞增殖受到明顯抑制，聯合組腎足細胞的生長要明顯好于順鉑組，見圖1。RTCA分析顯示，順鉑對腎足細胞具有較強的生長抑制作用，其抑制程度在一定時間(72 h)隨著作用時間增加而增強，聯合組腎足細胞的生長要好于順鉑組(P<0.05)，順鉑處理腎足細胞的半數致死濃度(IC50)值為5.30 μg/mL，24 h后達到最大抑制率，見圖2。

圖2 利用RTCA 實時分析不同分組腎足細胞的生長

2.2流式細胞儀檢測RAS-RH對腎足細胞凋亡的影響 細胞凋亡實驗結果顯示：藥物組[(6.24±0.35)%]與對照組[(2.68±0.11)%]的凋亡率比較差異無統計學意義(P=0.093)。順鉑組[(25.80±2.94)%]與對照組[(2.68±0.11)%]、藥物組[(6.24±0.35)%]、聯合組[(10.98±1.84)%]的凋亡率兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3流式細胞儀檢測不同分組凋亡率的代表圖

3 討 論

《中國藥典》載當歸為傘形科植物的干燥根，具有“補血、活血、調經止痛”等功效[3]。研究表明，當歸所含的生物活性物質主要是揮發性與非揮發性化學物質，而產生效應的主要有揮發油、藁苯內酯、阿魏酸、多糖等成分[4]。紅芪為豆科巖黃芪屬植物，《中國藥典》收載的常用中藥紅芪為多序巖黃芪的根，紅芪入藥史載于南北朝梁-陶弘景著的《本草經集注》，具有“扶正祛邪，益氣固本”的功效[3]。紅芪含有多糖、生物堿、黃酮、氨基酸等物質，且多糖為紅芪中最主要的活性成分，是一種雜多糖，具有抗氧化、抗癌、提高機體免疫力等作用[5]。寇寧等[6]研究表明，紅芪多糖具有較強的清除羥自由基、超氧陰離子自由基及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基等作用。近年來一些研究證明，RAS-RH中，紅芪補血，當歸養血，兩藥合用共奏補氣生血之功，使血氣旺盛，腎精髓海充足[7]。研究發現，紅芪多糖能明顯抑制多種腫瘤細胞增殖，可通過增強機體免疫能力抗癌，還能在體外致使腫瘤細胞周期停滯、誘導部分腫瘤細胞凋亡、對化療藥物起減毒增敏效果等[8]。王小軍等[9]利用四甲基偶氮唑藍(MTT)法和流式細胞術研究發現，紅芪多糖-1可促進人肺腺癌A549細胞活性氧自由基(ROS)、丙二醛(MDA)的上調，同時促進谷胱甘肽(GSH)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)的下調，不同劑量紅芪多糖-1均具有抗腫瘤活性的作用，提示其抑制人肺腺癌A549細胞增殖、誘導凋亡可能與調控細胞內氧化/抗氧化機制平衡有關。劉華等[10]通過流式細胞儀及RT-PCR法研究紅芪多糖誘導肺腺癌細胞凋亡與Bax/Bcl-2表達，觀察發現不同濃度的紅芪多糖均可誘導A549細胞凋亡，均可降低Bcl-2蛋白的表達，相應提高Bax蛋白的表達，且呈濃度依賴性，其機制可能是通過調節細胞內Bcl-2和Bax蛋白的表達而誘導A549細胞的凋亡。張艷霞等[11]采用MTT比色法檢測當歸揮發油對SPC-A-1細胞的細胞毒作用;流式細胞術檢測SPC-A-1細胞凋亡及周期;吖啶橙/溴化乙啶(AO/BE)雙熒光染色法觀察SPC-A-1細胞凋亡，研究發現當歸揮發油可誘導SPC-A-1細胞凋亡，推斷出當歸揮發油可能通過阻滯細胞于G2期，從而起到抑制SPC-A-1細胞增殖的作用。安靜等[12]實驗采用AOM/DSS誘導小鼠炎癥相關結直腸癌模型，探究當歸多糖、當歸油對腫瘤的預防作用，結果表明此兩種當歸提取物單獨使用時均具有降低腫瘤發病率及抑制腫瘤發展的作用，且兩者具有協同作用，以當歸油與高劑量的當歸多糖配伍對結直腸癌的發生、發展抑制作用最強。

順鉑作為主要抗腫瘤藥物，在臨床上被廣泛利用，但其在殺死腫瘤細胞的同時亦損傷正常細胞，且伴有嚴重的腎毒性[13]，成為順鉑化療在臨床上應用的瓶頸。腎小球足細胞的濾過功能是腎臟生理功能的基礎，足細胞病變是導致慢性腎小球腎炎濾過功能損傷的決定因素[14]。順鉑可導致DNA物理結構的損傷，而這些損傷能被細胞內的損傷識別蛋白所識別，從而啟動包括蛋白激酶、c-abl和p53在內的信號轉導途徑，這些途徑一經啟動都可誘導細胞凋亡[15]。

本研究采用倒置相差顯微鏡和RTCA 實時細胞分析觀察發現順鉑對大鼠腎足細胞的增殖具有明顯的抑制作用，而RAS-RH可以對順鉑導致的細胞損傷具有一定的保護作用；同時RTCA觀察細胞增殖抑制的動態改變，流式細胞儀檢測順鉑組[(25.80±2.94)%]的凋亡率要明顯高于對照組[(2.68±0.11)%]、藥物組[(6.24±0.35)%]、聯合組[(10.98±1.84)%]，差異均有統計學意義(P<0.05)，說明RAS-RH可以降低順鉑誘導的凋亡率。

綜上所述，RAS-RH對順鉑誘導的大鼠腎足細胞損傷作用具有一定的保護作用，其作用機制可能是RAS-RH通過下調大鼠腎足細胞的凋亡率而實現，但RAS-RH 如何具體影響凋亡細胞的分子機制仍有待進一步研究。