扁桃體肥大與咽喉反流的相關性研究

張麥葉，李進讓，梁 媛，張淑君△

(1.承德醫學院附屬醫院耳鼻喉科，河北承德 067000； 2.海軍總醫院全軍耳鼻咽喉頭頸外科中心，北京 100000)

扁桃體是腭扁桃體的一種俗稱，由淋巴組織構成，內含許多結締組織網和淋巴濾泡間組織。扁桃體肥大是指扁桃體體積的病態性增大，常伴隨睡眠時打鼾、張口呼吸、間斷憋氣憋醒或呼吸暫停、頻繁血氧飽和度下降、發音困難、聲音嘶啞、頻繁清嗓、刺激性咳嗽等臨床癥狀。研究顯示，耳鼻喉科門診中，接近10%的就診患者和超過50%的聲音嘶啞患者存在咽喉反流[1-2]。咽喉反流是指胃內容物異常反流進入上呼吸道而引起的一種慢性癥狀或黏膜損傷，臨床主要表現為發音困難、聲音嘶啞、頻繁清嗓、刺激性咳嗽等癥狀。胃蛋白酶只由胃黏膜主細胞分泌，一般認為，在上呼吸道的器官黏膜或分泌物中檢測出胃蛋白酶的表達，即表示發生了咽喉反流。胃蛋白酶作為咽喉反流的重要生物學指標，已被研究證實與耳鼻喉科許多疾病的發生密切相關，如聲帶白斑、咽喉炎、喉癌、慢性鼻竇炎、兒童分泌性中耳炎，但臨床上胃蛋白酶與扁桃體肥大的相關性研究鮮有報道[3]。本研究試圖把胃蛋白酶作為咽喉反流的生物學檢測指標，通過對肥大的扁桃體組織進行胃蛋白酶的檢測，探討扁桃體肥大與咽喉反流是否相關。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年2月至2017年10月就診于承德醫學院附屬醫院耳鼻喉科需行手術治療的扁桃體肥大患者67例，按照年齡大小分為兒童組(3～15歲)和成人組(20～60歲)，其中兒童組47例，成人組20例。兒童組扁桃體Ⅰ度肥大11例，Ⅱ度肥大17例，Ⅲ度肥大19例；成人組扁桃體Ⅰ度肥大2例，Ⅱ度肥大10例，Ⅲ度肥大8例。本研究經過承德醫學院倫理委員會批準。試驗開始前向患者及家屬詳細講解研究內容，所有患者及家屬均同意并簽署知情同意書。兒童組納入標準：(1)年齡小于18歲；(2)住院行全身麻醉手術；(3)藥物保守治療無效。成人組納入標準為：(1)年齡大于18歲；(2)住院行全身麻醉手術；(3)藥物保守治療無效。兩組患者的排除標準：(1)近期扁桃體急性感染，扁桃體急性彌漫充血、紅腫；(2)嚴重的炎性反應引起全身感染，如敗血癥、膿毒血癥；(3)2周內服用質子泵抑制劑，有咽喉反流癥狀或體征；(4)患有扁桃體腫瘤；(5)患有血液病、心功能不良、惡性腫瘤等而不能耐受手術；(6)近期服用阿司匹林、氯吡格雷等藥物引起凝血功能障礙、器官出血。

1.2方法

1.2.1試驗方法 67例扁桃體組織取活檢后，采用10%甲醛溶液固定，自動脫水機脫水，石蠟包埋，切片，每張片子厚度5 μm，烤片1 h,二甲苯脫蠟，3%過氧化氫去離子水37 ℃溫箱孵育30 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡，抗原修復，正常山羊血清工作液(無錫傲銳東源生物科技有限公司，批號k173301B)封閉。滴加1∶100的兔抗人胃蛋白酶多克隆一抗(英國Abcam公司，批號ab208922)，4 ℃過夜。37 ℃溫箱復溫40 min，PBS沖洗，滴加生物標記山羊抗兔/鼠的多克隆二抗(無錫傲銳東源生物科技有限公司，批號k173301B)。復溫40 min,PBS沖洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(無錫傲銳東源生物科技有限公司，批號k173301B)，復溫40 min,PBS沖洗，避光加入二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑(無錫傲銳東源生物科技有限公司，批號k166622C)，邊顯色邊電子顯微鏡下觀察，自來水終止顯色，蘇木素復染，氨水返藍，中性樹脂封片。

1.2.2結果判定 在低倍鏡(10倍)下觀察切片整體染色情況，PBS為陰性對照，健康人群胃黏膜為陽性對照。任選5個高倍鏡(400倍)視野觀察片子顯色深淺及顯色組織大小。依據Formwitz評分方法，顯色深淺：0分為不著色，1分為淡棕色，2分為棕褐色，3分為顆粒狀深棕褐色。顯色組織面積比例： 1分為<25%，2分為25%～50%，3分為>50%～75%，4分為>75%。顯色深淺與顯色面積比例相乘所得分值分為4個等級：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。整組陽性率=(弱陽性例數+陽性例數+強陽性例數)/標本總例數×100%。陰性率=(陰性例數/標本總例數)×100%。

1.3統計學處理 采用SPSS19．0進行數據處理，計數資料的組間差異比較采用χ2檢驗，如兩變量均為等級資料，則采用R×Cχ2檢驗和Spearman秩相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組患者胃蛋白酶的表達情況 兒童組、成人組胃蛋白酶的表達情況見表1。兒童組47例患者扁桃體組織胃蛋白酶表達陽性率為53.19%(25/47)，陰性率為46.81%(22/47)；成人組20例患者扁桃體組織胃蛋白酶表達陽性率為90.00%(18/20)，陰性率為10.00%(2/20)。兩組患者胃蛋白酶表達強度差異有統計學意義(χ2=8.268，P=0.004)。

表1 兩組患者的胃蛋白酶表達強度的比較(n)

2.2扁桃體肥大程度分級與胃蛋白酶表達強度的比較 兒童組扁桃體Ⅰ度肥大者胃蛋白酶表達陽性率18.18%(2/11)，陰性率81.82%(9/11)；扁桃體Ⅱ度肥大者胃蛋白酶表達陽性率58.82%(10/17)，陰性率41.18%(7/17)；扁桃體Ⅲ度肥大者胃蛋白酶表達陽性率68.42%(13/19)，陰性率31.58%(6/19)。兒童組扁桃體肥大程度與胃蛋白酶表達強度比較差異有統計學意義(χ2=9.995，P<0.05)，見表2。Spearman秩相關結果提示兒童扁桃體肥大程度分級越高，胃蛋白酶表達強度越高(r=0.406，P<0.05)。

成人組扁桃體Ⅰ度肥大組胃蛋白酶陽性率50.00%(1/2)，陰性率50.00%(1/2)；扁桃體Ⅱ度肥大組胃蛋白酶陽性率90.00%(9/10)，陰性率10.00%(1/10)；扁桃體Ⅲ度肥大組胃蛋白酶陽性率100.00%(10/10)，無陰性表達。成人組扁桃體肥大程度與胃蛋白酶表達強度比較差異無統計學意義(χ2=5.542，P>0.05)，見表3。Spearman秩相關結果提示成人組扁桃體肥大程度與胃蛋白酶的表達強度無相關性(r=0.099，P>0.05)。采用免疫組織化學方法，胃蛋白酶在扁桃體肥大組織中的表達情況見圖1～6。

表2 兒童組扁桃體肥大程度與胃蛋白酶表達強度的相關性

表3 成人組扁桃體肥大程度與胃蛋白酶表達強度的相關性

3 討 論

扁桃體肥大是耳鼻咽喉頭頸外科常見的疾病之一，發病率較高。它經常引起口腔臨床癥狀，尤其是咽腔狹窄，上氣道塌陷，從而引發不同程度的睡眠障礙與低通氣量。既往對扁桃體肥大的病因學研究多集中在免疫學方面，而扁桃體肥大與咽喉反流是否有相關性的研究目前較少。如何診斷咽喉反流是個世界難題，目前缺少規范全面、大眾認可的標準，常用反流癥狀指數量表(RSI)和反流體征量表(RFS)[4-5]，但量表評分的準確性易受醫生操作技術的熟練程度和患者主觀評判影響，因此可能出現誤差。痰液胃蛋白酶檢測的具體取樣時間不固定，且24 h內胃蛋白酶含量波動較大，學者李進讓等[6]研究發現健康人痰液內含有一定量的胃蛋白酶，猜測健康人可能存在生理性咽喉反流。考慮痰液檢測胃蛋白酶特異性不高，24 h雙探頭喉咽食管pH檢測受電極放置位置影響較大、敏感度不高、假陽(陰)性率較高且檢查費用昂貴，其臨床應用受到了限制。因此本試驗采用免疫組織化學方法檢測胃蛋白酶，從細胞層面對胃蛋白酶進行精確定位與診斷。

胃蛋白酶是由胃黏膜主細胞產生的一種消化酶，主要功能是分解食物中的蛋白質，利于食物消化吸收。胃蛋白酶原最初以無活性的前體形式存在，與鹽酸結合后轉化為有活性的胃蛋白酶。其活性受環境影響變化較大，尤其是酸堿度。研究表明在pH為2時胃蛋白酶活性最強；在中性環境中活性較低，但并未完全失活，只是處于一種休眠模式，當環境再度酸化后，有部分胃蛋白酶能恢復活性；在堿性環境中尤其是pH為8時，胃蛋白酶完全失活，而且不可逆[7]。GILL等[8]將咽喉反流患者作為試驗組，健康人做對照組，分別取喉黏膜組織進行檢測，結果發現胃蛋白酶存在于咽喉反流患者的喉黏膜，而健康人喉黏膜未發現胃蛋白酶。譚嘉杰等[3]研究喉癌時發現反流黏附在上皮的胃蛋白酶可通過受體介導的胞吞作用進入上皮細胞，引起上皮損傷。OREILLY等[9]的Western blot結果證實胃蛋白酶的主要成分——胃蛋白酶A不能在胃以外的部位產生，提示除胃以外的其他任何器官檢測出胃蛋白酶，即表明該器官存在咽喉反流。AHMED等[10]對分泌性中耳炎患者進行24 h雙探針咽喉食管pH監測，并測定中耳滲出液中胃蛋白酶的含量。pH結果顯示，分泌性中耳炎患者中咽喉反流的概率高達71%，胃蛋白酶在中耳滲液中的含量遠高于血清，中耳胃蛋白酶含量與咽喉反流次數呈正比。提示咽喉反流參與分泌性中耳炎的發生，說明胃蛋白酶含量測定可以作為咽喉反流的一個可靠生物學指標。

本結果提示，兒童組、成人組扁桃體肥大組織的鱗狀上皮細胞的胞核及胞質均存在胃蛋白酶的表達，且成人組胃蛋白酶的表達強度明顯高于兒童組，且成人發生咽喉反流的概率較高，說明扁桃體肥大與咽喉反流有相關性。猜測成人容易引起咽喉反流的原因與成人年齡較大，病史較長，受到咽喉反流的刺激較多及暴露在酸性環境中的時間較長有關，且成人基礎疾病較多，生活環境中空氣質量較差，呼吸道黏膜更易受損傷。KIM等[11]對54例兒童扁桃體肥大和30例成人扁桃體肥大患者進行免疫組織化學、Western blot、PCR、免疫熒光、流式細胞儀分析研究，發現扁桃體組織中存在胃蛋白酶，且主要存在于扁桃體破碎的鱗狀上皮，其次是隱窩上皮和周圍生發中心，提示扁桃體肥大與咽喉反流存在相關性，與本研究結果一致。同時，本研究結果進一步表明成人扁桃體肥大程度分級與胃蛋白酶的表達強度無相關性，考慮可能是原因本研究樣本量較少，檢驗的功效性較低，在后續試驗中應擴大樣本量，繼續深入研究。

本研究同時提示扁桃體肥大以兒童患者居多，許多扁桃體肥大的兒童存在咽喉反流。我國目前對兒童咽喉反流的研究并不多，國外研究表明2歲以下的兒童胃食管反流的發病率高達59%[12-13]。一般認為兒童年齡小，依從性差，配合度低，體征的檢查受限，且兒童咽喉反流的癥狀復雜多樣，病情變化較快且不典型，因此兒童咽喉反流往往被忽略，容易造成漏診誤診，延誤治療。

既往認為扁桃體肥大是由慢性炎癥刺激引起，但對癥服用藥物后癥狀并無改善，因此常采取手術治療方式改善癥狀，提高生存質量。本研究雖未明確咽喉反流在扁桃體肥大中的具體發病機制，但結果顯示兒童胃蛋白酶強度與扁桃體肥大有相關性，提示兒童咽喉反流與扁桃體肥大可能相關。