基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術治療Ｇ６ＰＤ缺乏癥的運用前景*

周燕霞 綜述，張鵬輝 審校

(重慶醫科大學附屬兒童醫院臨檢中心/兒童發育疾病教育部重點實驗室/兒童發育重大疾病國家國際技合作基地/認知發育與學習記憶障礙轉化醫學重慶市重點實驗室，重慶 400014)

葡萄糖-6-磷酸酶(G6PD)缺乏癥又稱為蠶豆病。希臘的兒科醫生最早發現食用蠶豆的兒童中可能出現嚴重的貧血和血紅蛋白尿。隨后，研究發現對羥喹啉敏感者的紅細胞缺乏G6PD酶，而G6PD缺乏癥可能受到瘧疾選擇，之后該領域的研究逐漸受到人們的關注。

G6PD缺乏癥主要發現于東南亞、非洲、中東和地中海沿岸，全世界約4億患者，男性多于女性[1]。我國G6PD缺乏癥的分布呈南高北低趨勢，廣東、廣西、海南等地人群患病率高。但隨著人口流動性增加，患病率較低的地區也呈現增高趨勢。

1 G6PD缺乏癥

G6PD是一種從原核生物到動物都存在的X染色體連鎖的胞質酶。人類G6PD基因位于Xq28，長約20 kb，編碼515個氨基酸。G6PD缺乏癥是由于G6PD基因突變引起的，其突變主要集中在第4、5、6、8、10號外顯子[2]。人類基因突變數據庫(HGMD)與GMEZ-MANZO 等[3]報道的G6PD基因突變型為217種，多為單個堿基置換導致的錯義突變，少數為無義突變、剪接突變和小缺失，已發現的所有突變都在基因的編碼區，且絕大多數影響蛋白結構的穩定性[4]。我國人群中已發現G6PD基因突變位點超過20種，以95A>G,1 376G>T,1 388G>A最常見，占總突變的50%～60%[5]。

G6PD缺乏癥患者紅細胞膜表面的G6PD酶缺乏，這導致了紅細胞磷酸戊糖途徑中谷胱甘肽還原酶的輔酶-還原型輔酶Ⅱ(NADPH)生成減少，使得維持紅細胞膜穩定性的還原型谷胱甘肽(GSH)減少而不能抵抗氧化損傷，最終導致紅細胞破壞并溶血[6]。WHO根據G6PD酶的活性缺乏程度及臨床表現，將該病分成Ⅰ～Ⅴ 5種亞型。G6PD缺乏癥臨床表現的嚴重程度與酶功能障礙的等級相關[7]，主要分為新生兒黃疸、急性溶血性貧血和慢性非球形紅細胞溶血性貧血3類。

2 G6PD缺乏癥的預防與治療

G6PD缺乏癥患者多數平時無臨床癥狀，早期診斷和干預非常重要。在G6PD缺乏癥的高發地區，所有新生兒應開展G6PD缺乏癥篩查和健康教育，禁用、慎用某些食物[8]及藥物(如抗瘧疾藥物[9]、磺胺類藥物、鎮痛藥、砜類藥物[10]、亞甲藍和萘等[11])。當出現急性溶血時，應立即停止接觸和攝入可疑食物和藥物并給予對癥治療，貧血較重時可輸注G6PD正常的紅細胞，防治腎衰竭。對于新生兒黃疸，根據膽紅素的水平及個體情況，給予藥物、藍光照射或換血療法，藍光治療是最常用且安全有效的方法，能有效降低膽紅素濃度，預防膽紅素腦病的發生。由G6PD缺乏所致的慢性非球形紅細胞溶血性貧血(CNSHA)患者，一般無特殊治療，但出現再障危象時輸血是救命的措施之一。

3 G6PD缺乏癥治療前景及展望

G6PD缺乏癥的本質為基因突變，基因治療是其根本療法。近年來，成簇規律間隔短回文重復序列及相關蛋白9(CRISPR/Cas9)精確的基因編輯技術為基因治療開啟了新方向，可與誘導多功能干細胞(iPSCs)技術相結合，為患者定制個性化治療方案。

3.1iPSCs iPSCs是基因治療的理想細胞工具，是將一些多能遺傳基因導入成熟體細胞中，使其重編程為與胚胎干細胞(ESC)具有相似特征的一種干細胞[12]，可以用于包括G6PD缺乏癥在內等各種遺傳疾病的疾病建模。隨著iPSCs技術的出現，各種體細胞來源的iPSCs研究迅速出現[13-14]，證明了患者來源的iPSCs治療血液疾病如鐮狀細胞貧血和地中海貧血癥的潛力。使用基因編輯技術，通過糾正源于患者的iPSCs中潛在的致病性突變來構建臨床相關的治愈性干細胞，然后將其分化為所需的祖細胞用于植入和細胞替代療法。

3.2CRISPR/Cas9系統 CRISPR/Cas9是新出現的一種由RNA指導Cas9核酸酶對靶基因進行編輯的基因編輯系統，是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御系統[15]。其原理為crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。通過人工設計這兩種RNA，可改造成具有引導作用的sgRNA(singleguide RNA)，引導Cas9對DNA的定點切割。原型間隔序列毗鄰基序(PAM)是CRISPR/Cas9至關重要的一部分，序列為5′-NGG-3′[16]。PAM區是一段高度保守的序列，它在識別靶向DNA中有重要的作用，只有靶序列位于PAM的5′端附近時，Cas9才對靶序列進行切割。

與已經開發了的其他基因編輯技術相比，Cas9核酸酶是已知的第1個能夠共定位RNA、DNA和蛋白質的分子，其特點包括：(1)易于設計，可人工設計與目的序列互補的20-nt的引導序列sgRNA；(2)特異性高，不同的sgRNA可引導Cas9酶對DNA的定點切割；(3)成本低，周期短；(4)適合于多種細胞類型和生物體的高通量和多路基因編輯的系統[17]；(5)脫靶效率高且目的序列5′到3′端需靠近PAM區等。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術，可實現基因插入、敲除、定點替換及染色體重組等，這為生物體的研究和改造帶來了巨大潛力。

3.3CRISPR/Cas9技術在遺傳性疾病中的應用 CRISPR/Cas9作為可編程系統被發現后，相關應用研究迅速升溫，從農作物編輯、轉錄和表觀遺傳學調控到各種疾病治療等方面均得到應用，目前，用于癌癥治療[18]和降低HIV病毒載量[19]的Ⅰ期臨床試驗正在積極開展，應用前景十分廣闊。由于其強大的基因組編輯能力，CRISPR/Cas9系統的優勢領域是遺傳性疾病。該技術常應用于多種遺傳性疾病，如杜氏肌營養不良[20]、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥[21]、Crygc基因突變引發的白內障[22]、X連鎖慢性肉芽腫病[23]、囊性纖維化[24]等。

在血液系統遺傳性疾病中，OHMORI等[25]利用CRISPR/Cas9技術在體內創建和校正了血友病B的小鼠模型，為其臨床應用奠定基礎。XIE等[26]利用CRISPR/Cas9修復地中海貧血患者來源的iPSCs中的致病基因，并將修復后的iPSCs誘導分化成紅細胞，檢測此細胞能產生正常的β-球蛋白，解決了地中海貧血癥所引起的病變。HUANG等[27]用CRISPR/Cas9系統對鐮狀細胞性貧血患者iPSCs的HBB基因進行基因編輯，基因修正后的iPSCs可以誘導分化至網織紅細胞階段，且表達正常的β-球蛋白。這些研究都提示利用CRISPR/Cas9聯合iPSCs技術治療G6PD缺乏癥的可行性。

3.4CRISPR/Cas9應用于G6PD缺乏癥 SPENCER等[28]利用CRISPR/Cas9系統產生了G6PD基因敲除體細胞(肝)細胞系，敲除G6PD基因后G6PD表達下降，提示CRISPR/Cas9系統可用于G6PD基因組的編輯。TANG等[29]運用合適的sgRNA和同源供體復合的Cas9蛋白注射入單細胞人胚胎中，證明有效的同源重組可介導G6PD基因中點突變的校正。已報道G6PD基因突變中約83.9%為單基因突變，其中約一半為WHO-Ⅰ型，可導致嚴重的慢性溶血性貧血，臨床治療效果不佳[5]。根據CRISPR/Cas9系統的編輯原理，sgRNA可引導Cas9蛋白在PAM區上游的3～8堿基處切割目的DNA[30]，則利用CRISPR/Cas9技術可修復G6PD缺乏癥的大部分突變位點，包括95A>G,1 376G>T、1 024C>T等我國最常見的幾種突變。人工設計針對導致G6PD缺乏癥突變位點的特異性sgRNA，引導Cas9蛋白對突變位點進行切割，同時提供DNA 修復模板進行同源修復(HDR)，達到修復突變位點的目的。可將G6PD缺乏癥患者的體細胞重編程為iPSCs，利用CRISPR/Cas9技術修復G6PD缺乏癥患者來源的iPSCs中的致病突變，再將修復后的iPSCs誘導分化為紅系祖細胞移植到G6PD缺乏癥患者體內，達到治療的目的。

總之，CRISPR/Cas9系統聯合iPSCs技術是一種治療G6PD缺乏癥的理想策略。該系統作為遺傳性疾病新型治療技術的前沿，具有廣闊的應用前景。