FBXO31與細(xì)胞周期蛋白D1在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)及臨床意義

王 杰，向德兵，唐 瑤，孫貴銀△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 646000；2.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科 402260)

結(jié)直腸癌是全球第三大高發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在我國(guó)居惡性腫瘤第5位[1]。據(jù)以往研究，在腫瘤的形成和進(jìn)展過(guò)程中，細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控分子的異常表達(dá)發(fā)揮了重要作用，細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1通過(guò)調(diào)控G1和S期轉(zhuǎn)化影響細(xì)胞周期進(jìn)程，在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[2]。泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是生物體內(nèi)重要的蛋白翻譯后修飾體系，參與諸多病理生理過(guò)程。FBXO31是泛素連接酶SCF復(fù)合體中的關(guān)鍵組分，負(fù)責(zé)底物的識(shí)別與招募，研究發(fā)現(xiàn)FBXO31通過(guò)泛素化作用于不同基質(zhì)，發(fā)揮不同作用，它通過(guò)對(duì)Cyclin D1的調(diào)節(jié)來(lái)影響細(xì)胞周期，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。目前對(duì)FBXO31及Cyclin D1在黑色素瘤、胃癌、乳腺癌中的作用均有報(bào)道[4-6]，但結(jié)直腸癌中FBXO31的表達(dá)情況及其與Cyclin D1的關(guān)系尚不明確，本研究采用免疫組織化學(xué)的方法研究結(jié)直腸癌中FBXO31與Cyclin D1的表達(dá)情況，并分析二者相關(guān)性及其臨床病理意義，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2014年1月1日至2017年12月31日收治的病理確診、臨床資料完整的146例結(jié)直腸腺癌及癌旁組織標(biāo)本，術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療。

1.2方法

1.2.1IHC染色法 蠟塊切片脫蠟至水，檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)，免疫組織化學(xué)染色采用SP法，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，復(fù)染、封片、鏡檢，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，一抗?jié)舛菷BXO31為1∶200，Cyclin D1為工作液。已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。兔抗Cyclin D1單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司，兔抗FBXO31多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Origene公司。

1.2.2結(jié)果判定 由本院工作經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師雙盲閱片，低倍鏡下(×100)閱覽整張切片顯色情況后選取高表達(dá)區(qū)于高倍鏡(×400)下進(jìn)一步觀察，取5個(gè)視野評(píng)分。按染色強(qiáng)度評(píng)分：不著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；按陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分：未染色計(jì)0分，<25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，>50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。兩項(xiàng)計(jì)分相乘確定：≤2分為陰性，>2分為陽(yáng)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1FBXO31、Cyclin D1的表達(dá)情況 FBXO31主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，偶見細(xì)胞核表達(dá)，呈棕黃色，癌旁組織、腺癌組織表達(dá)陽(yáng)性率分別為76.71%(112/146)、36.99%(54/146),兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Cyclin D1表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕黃色，細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)未見表達(dá)，癌旁組織與腺癌組織表達(dá)陽(yáng)性率分別為16.44%(24/146)、69.86%(102/146),兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1、表1。

表1 FBXO31、Cyclin D1在癌旁、腺癌組織的表達(dá)情況

2.2FBXO31、Cyclin D1水平與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 FBXO31和Cyclin D1水平與結(jié)直腸腺癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)(P<0.05)，另外，Cyclin D1水平與腫瘤分化程度也相關(guān)(P<0.05)。FBXO31和Cyclin D1水平與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)，見表2。

2.3FBXO31和Cyclin D1在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)的關(guān)系 在146例結(jié)直腸腺癌中，17例FBXO31和Cyclin D1均被檢測(cè)到，7例二者均未檢測(cè)到。FBXO31與Cyclin D1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，見表3。

表2 FBXO31、Cyclin D1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

表3 FBXO31與Cyclin D1在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

近年來(lái)，大量基因?qū)用媾c蛋白質(zhì)層面的研究深入探討了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，為腫瘤的防治工作做了大量鋪墊。蛋白質(zhì)的合成與分解是細(xì)胞的基本生命活動(dòng)，UPS是生物體內(nèi)重要的蛋白翻譯后修飾體系，它具有高度選擇性，在細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，主要由泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3及26S蛋白酶體共同參與，是一個(gè)精密有序的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，其中泛素連接酶E3是UPS選擇性的關(guān)鍵，負(fù)責(zé)底物的特異性識(shí)別和招募[3]。FBXO31是位于16q24.3的衰老基因，是F-box蛋白家族的一員，參與構(gòu)成SCF復(fù)合體(隸屬于泛素連接酶E3中的RING-finger家族)，KUMAR等[6]通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，F(xiàn)BXO31是以SCFFBXO31復(fù)合體的形式在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用的，其多種生物學(xué)功能通過(guò)特異性識(shí)別和招募底物并介導(dǎo)底物蛋白的泛素化降解來(lái)實(shí)現(xiàn)，通過(guò)作用于不同靶蛋白，F(xiàn)BXO31參與了腫瘤形成、神經(jīng)元發(fā)育[7]及DNA損傷應(yīng)答[8]等多種病理生理過(guò)程。已有研究證實(shí)FBXO31在乳腺癌[6,9]、肝癌[10]、胃癌[5,11]、黑色素瘤[4]中可能發(fā)揮抑癌作用，在肺癌、食管癌[12-13]中表達(dá)上調(diào)，是可能的致癌因子。FBXO31的抑癌作用與其介導(dǎo)泛素化降解Cyclin D1、Cdc10依賴性轉(zhuǎn)錄因子(Cdt1)、Slug、鼠雙微體2(MDM2)、叉頭盒蛋白質(zhì)M1(FOXM1)等基質(zhì)有關(guān)[3]，而致癌機(jī)制目前尚不太明確。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)BXO31在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)降低，且浸潤(rùn)越深，TNM分期越高，其表達(dá)率越低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者陽(yáng)性率低，提示其低表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

細(xì)胞周期是所有真核細(xì)胞生命活動(dòng)的基石，一個(gè)完整的細(xì)胞周期包含了G1、S、G2和M共4個(gè)時(shí)期，它的轉(zhuǎn)換受Cyclin和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)驅(qū)動(dòng)。Cyclin D1在CDK4、CDK6的協(xié)同作用下推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)變，Cyclin D1的過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞周期阻滯和促凋亡功能喪失，細(xì)胞快速生長(zhǎng)，研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1在多數(shù)惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)[2]。以往研究表明，Cyclin D1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，并可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。本研究證實(shí)，Cyclin D1在結(jié)直腸腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率較癌旁組織明顯升高，且分化程度越低，浸潤(rùn)深度越深，TNM分期越高，其陽(yáng)性表達(dá)率越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，這與前人研究[2,14]結(jié)果一致。

FBXO31是一個(gè)具有細(xì)胞監(jiān)視功能的蛋白，可以迅速應(yīng)答DNA損傷，它通過(guò)識(shí)別并結(jié)合Cyclin D1的C末端，介導(dǎo)其泛素化降解，使細(xì)胞阻滯在G1期，從而阻止DNA損傷細(xì)胞的繼續(xù)生長(zhǎng)，發(fā)揮潛在的抑癌作用[15]。SANTRA[4]等研究發(fā)現(xiàn)，不同的DNA損傷劑都可以誘導(dǎo)FBXO31水平大幅增加。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸腺癌中，F(xiàn)BXO31呈低表達(dá)，Cyclin D1呈過(guò)表達(dá)，且二者表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)性，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，F(xiàn)BXO31的低表達(dá)可能使結(jié)直腸癌細(xì)胞逃脫DNA損傷監(jiān)視，繼發(fā)性引起Cyclin D1的表達(dá)升高，從而參與了結(jié)直腸癌形成和發(fā)展的整個(gè)過(guò)程，了解二者的表達(dá)情況有助于評(píng)估結(jié)直腸腺癌的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后情況，且二者有望成為結(jié)直腸腺癌治療的新靶點(diǎn)，本研究也為進(jìn)一步深入探索FBXO31在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。