肌動蛋白相關蛋白2/3復合體4在結直腸癌組織中的表達及其對侵襲能力的影響

任海亮，李云濤，張 抒，龍飛伍，古建輝

(四川省成都市第三人醫院普外科 610031)

結直腸癌(CRC)是目前世界上常見的危害嚴重、高發病率的惡性腫瘤之一，數據統計顯示全球每年平均大約有100萬的結直腸癌新增患者，其病死率高達50%[1]。近年來，我國國民經濟水平顯著提高，環境和人們日常膳食結構也隨之改變，我國的結直腸癌發病率和病死率呈現逐漸上升的趨勢，結直腸癌的發病率已高居惡性腫瘤的第3位，病死率在所有惡性腫瘤中排第5位[2]。結直腸癌患者的手術后復發和不可控性轉移是導致結直腸癌患者最終死亡的關鍵因素之一[3-4]，因此及早發現和診斷結直腸癌可以為患者提供良好的治療機會，提高結直腸癌的預后。肌動蛋白相關蛋白2/3(Arp2/3)復合體(ARPC)4是Arp2/3復合體的一個亞基，相對分子質量為20×103。Arp2/3是一個穩定的橢球狀復合體，相對分子質量220×103，由進化上保守的7個亞基組成，包括兩個肌動蛋白相關蛋白Arp2和 Arp3亞基，以及5個附屬亞基ARPC1、ARPC2、ARPC3、ARPC4、ARPC5。ARPC4與ARPC2形成的C型結構，作為組成Arp2/3復合體的中心，其他亞基互相作用環繞該中心共同構成穩定的Arp2/3復合體[5-6]。Arp2/3復合體是一個主要的肌動蛋白組裝成核劑，能夠促進肌動蛋白單體核化裝配形成微絲，在維持細胞形態、構成細胞骨架及運動等多種與肌蛋白相關生理活動中具有重要作用[7-8]。杜江等[9]研究發現，下調ARPC5能夠顯著抑制肺鱗癌細胞株的增殖、侵襲和轉移，而ARPC4的相關研究較少，本研究旨在通過免疫組織化學、Western blot、實時熒光定量PCR技術檢測ARPC4在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達情況，并結合臨床資料探討ARPC4蛋白與結直腸癌各臨床病理指標及預后的關系；并進一步在結直腸癌細胞中敲降ARPC4基因，用Transwell及Western blot等手段檢測ARPC4與結直腸癌侵襲的關系及內在的分子機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2006-2008年的新鮮結直腸癌手術標本和癌旁組織20例及石蠟包埋結直腸癌標本110例，根據WHO2004年的結直腸癌組織學分型標準進行分型，根據國際抗癌聯盟2009年發布的第7版結直腸癌TNM分期系統進行分期。其中的臨床病理指標判斷均由臨床專家和病理專家作出。癌旁組織均為距癌腫病灶大于或等于5 cm的組織。所有患者術前均未接受過物理治療或化學藥物治療。本研究已通過醫院倫理委員會批準(批準號：倫審-2015-S-12)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1主要試劑 人結直腸癌細胞系HCT-8細胞購自上海細胞庫；兔抗人ARPC4多克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗基質金屬蛋白酶(MMP)-2多克隆抗體、兔抗MMP-9多克隆抗體、鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自德國CST公司；免疫組織化學二抗試劑盒PV-9000購自北京中衫金橋生物技術有限公司；反轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；Real-time試劑盒購自美國Promega公司。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測ARPC4的mRNA表達 按Trizol試劑說明書操作，提取總RNA，通過變性凝膠電泳檢測RNA純度和完整性，并逆轉錄為cDNA。以合成的cDNA為模板，加入相應目的基因的上下游引物(表1)。實時熒光定量PCR染料后，用實時熒光定量PCR儀檢測(每組設3個復孔)。PCR反應的條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 25 s，40個循環；95 ℃ 15 s，57 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。擴增結束，計算mRNA表達相對水平比率，求2-ΔΔCt。

1.2.3Western blot檢測結直腸組織及細胞系中蛋白表達 按照細胞1×106或0.5 cm3體積的組織加100 μL的RIPA蛋白裂解液，二喹啉甲酸 (BCA) 試劑盒測定蛋白水平，并定量。每孔20 μL總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后再將蛋白轉到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜，一抗比例 (ARPC4 1∶1 000，GAPDH 1∶2 000)，二抗室溫孵育2 h，電化學發光(ECL)液化學發光檢測。

表1 實時定量PCR引物

1.2.4免疫組織化學法檢測ARPC4蛋白的表達 石蠟包埋結直腸癌標本常規脫蠟，加一抗4 ℃過夜。次日滴加SP標記的二抗，37 ℃孵育1 h，二氨基聯苯胺(DAB)顯色后蘇木精復染，并常規脫水、透明和封片。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。染色評判標準以腫瘤細胞細胞膜和細胞質著色為基準，在低倍鏡對染色的強度和染色細胞百分比進行評估，計數20個高倍視野的免疫組織化學反應著色的細胞，染色強度積分為：無染色0分，弱染色1分，中等染色2分，強染色3分；染色面積積分為：著色范圍小于或等于10%為0分，>10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。若兩者積分之和大于或等于3分則為陽性，低于3分則為陰性。免疫組織化學結果由本院病理科兩位資深老師各自單獨評分，后經匯總，對有差異的評分經復核商討后得到最終一致結果。

1.2.5ARPC4蛋白表達與結直腸癌各種臨床病理指標之間的相關性分析 收集110例石蠟標本患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤細胞分化程度、T分期、淋巴結轉移情況、遠處轉移情況、臨床分期等資料，將相關資料與ARPC4蛋白表達情況做相關性分析。

1.2.6ARPC4表達與結直腸癌術后預后關系分析 對入組的結直腸癌患者進行定期隨訪，并根據術后3年的隨訪結果分析ARPC4表達與結直腸癌患者預后的關系。

1.2.7穩定敲降細胞株構建 構建針對ARPC4基因的慢病毒敲降載體和對照載體，靶點序列：5′-AUCCACUUCAUGGAGGAGAUUGACA-3′，對照序列：5′-AUAGCAUAACAUCCUAGACACCAAC-3′。取對數期ARPC4結腸癌細胞鋪6孔板，細胞每孔1×106，感染慢病毒后12 h換成新鮮培養基，繼續培養。

1.2.8細胞侵襲能力的測定 Transwell上室先加50 μL 1∶33稀釋的Matrigel，于37 ℃孵箱中孵育30 min，小心吸去上清液，待用。用胰酶消化轉染慢病毒敲除載體和對照載體的HCT-8細胞，每個樣品孔按200 μL無血清1640培養基重懸2×104的量收集細胞，小心加到Transwell上室中央，下室添加含20%胎牛血清(FBS)的1640培養基900 μL，加好樣品后恒溫培養箱中孵育24 h，棉簽小心擦去上室殘留的細胞，用PBS清洗3次，用甲醇1 mL固定細胞20 min，室溫吹干，用0.5%的結晶紫染色1 min，PBS清洗，將上室薄膜用小刀切下，置于載玻片上，固定，封片，顯微鏡下觀察計數。

2 結 果

2.1結直腸癌和癌旁組織中ARPC4表達 選取20例結直腸癌組織和癌旁組織進行實時熒光定量PCR檢測，結果顯示，結直腸癌組織ARPC4的mRNA表達量較癌旁組織明顯上調(圖1)。Western blot檢測結果顯示ARPC4在結直腸癌中的表達水平明顯高于癌旁組織，見圖2。

圖1 實時熒光定量PCR檢測ARPC4在結直腸癌組織中的表達

N：癌旁組織；C：結直腸癌組織

2.2ARPC4在組織中的免疫組織化學結果 ARPC4在結直腸癌組織中以陽性表達為主，在癌旁正常組織中以陰性表達為主，且ARPC4的表達主要在細胞質中。ARPC4蛋白在110例的結直腸癌組織中的陽性率為59%(65/110)，而在癌旁組織為12%(13/110)，前者明顯高于后者(P<0.01)，見圖3。

2.3ARPC4蛋白表達與結直腸癌各種臨床病理指標之間的相關性分析 不同的性別，年齡，腫瘤大小、分化程度和T分期的患者結直腸癌組織細胞中ARPC4的表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；ARPC4的陽性表達率與淋巴結轉移、遠處轉移及臨床分期有相關性(P<0.05)，見表2。

表2 結直腸癌組織中ARPC4蛋白表達與臨床病理指標的關系(n=110)

2.4ARPC4表達與結直腸癌術后無瘤生存期的關系 ARPC4表達在判斷結直腸癌患者預后中的價值見圖4和表3。在本研究檢測的110例患者中，術后3年的無瘤生存率為61%(67/110)。其中，ARPC4陽性表達患者術后3年的無瘤生存率為51%(33/65)，而陰性表達患者的3年無瘤生存率為76%(34/45)。Kaplan-Meier分析結果顯示，ARPC4表達陽性患者的3年無瘤生存時間明顯短于ARPC4表達陰性患者(P=0.010)。Cox多因素回歸分析顯示，ARPC4陽性表達可以作為結直腸癌患者預后不良的獨立預測因素(P=0.035)。

圖4 ARPC4蛋白表達與結直腸癌患者無瘤生存期的關系

2.5ARPC4對結直腸癌侵襲及相關分子的影響 結果顯示轉染敲降載體后ARPC4表達水平明顯的下調；Transwell實驗結果顯示，與對照組相比，ARPC4敲降后的HCT-8細胞的侵襲能力有明顯下降(圖5)。Western blot檢測發現，侵襲相關MMP-2和MMP-9的表達在ARPC4敲降的HCT-8細胞中均有不同程度的下調，見圖6。

圖6 ARPC4下調抑制HCT-8細胞中MMP-2和MMP-9表達

表3 單因素和多因素Cox回歸分析

-：無數據

3 討 論

Arp2/3復合體能夠促進結直腸癌細胞在基質中的運動性，進而為腫瘤細胞的浸潤提供更適合的環境[10]。內皮細胞的黏著連接在生理和病理過程中都是極其重要的，通過與肌動蛋白微絲細胞骨架的相互作用來調控，β-catenin 與E-cadherin結合并形成catenin/cadherin復合體，進而維持細胞之間的黏附性，Arp2/3復合體能夠抑制catenin/cadherin復合體的形成，從而使得β-catenin在細胞質內大量聚集，并進一步入核，促進細胞周期相關基因并調節侵襲轉移相關基因的轉錄，促進腫瘤細胞侵襲和轉移[11-12]。

ARPC4是組成Arp2/3復合體的亞單位，可以促進微絲合成，參與細胞骨架的重構[13-14]，細胞骨架是細胞中的一類蛋白纖維網絡體系，主要由微管、微絲和中間纖維組成，參與了細胞運動、細胞增殖與分化等細胞大部分重要的生命活動，因此在腫瘤細胞中細胞骨架的結構及功能的改變將會影響腫瘤的發生和發展[15-16]。

胰腺癌細胞中過表達ARPC4，而敲降胰腺癌細胞系中Arp2/3復合體亞基后，細胞的遷移能力受到了抑制。尤其是將ARPC4下調后，所有胰腺癌細胞系的遷移能力都表現出明顯的下降[15]。與該研究類似，本研究發現ARPC4表達與結直腸癌淋巴結轉移和遠處轉移有相關性，推測ARPC4可能與結直腸癌的侵襲相關，而后續的研究發現，下調ARPC4能夠明顯抑制結直腸癌細胞的侵襲能力。

癌細胞發生侵襲的過程中，細胞外基底膜的改變是重要環節[17-18]，癌細胞分泌MMP-2、MMP-9等多種蛋白水解酶，降解、侵襲基底膜，使癌細胞能夠穿越基底膜脫離原發灶，從而進入血液或淋巴循環發生腫瘤轉移[19]，因此，降低癌細胞侵襲能力是抑制腫瘤轉移的關鍵。同樣的，本研究中， MMP-2、MMP-9在ARPC4敲降后均有明顯的下調，說明ARPC4可能主要通過MMP來影響結直腸癌的侵襲轉移。而β-catenin能夠與MMP啟動子結合，促進MMP家族蛋白的表達[20-21]。基于此，本課題組推測，ARPC4可能是通過影響β-catenin/E-cadherin復合體，激活β-catenin通路，促進MMP-2和MMP-9的轉錄，最終促進結直腸癌的侵襲、轉移。

本研究結果表明ARPC4在結直腸癌組織中的表達高于癌旁組織，在結直腸癌組織中的陽性表達與腫瘤的淋巴結轉移及患者預后不良密切相關，可成為一個新的預測結直腸癌轉移及預后的分子標志。