基于降低TLR9表達(dá)的電針聯(lián)合疼痛貼對(duì)骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用研究

覃雙來(lái)，吳永貴，關(guān)江鋒，張 秋

(1.湖北省武漢市第一醫(yī)院腫瘤科 430022；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，武漢 430065； 3.湖北省武漢市第一醫(yī)院耳鼻咽喉科 430022)

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，約70%的腫瘤患者有難以緩解的癌痛[1-2]。 癌癥骨轉(zhuǎn)移是癌性疼痛的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[3]。目前，控制骨癌痛以“三階梯療法”為主，但長(zhǎng)期使用鎮(zhèn)痛藥存在毒副反應(yīng)大、成癮依賴性強(qiáng)、免疫功能抑制、個(gè)體差異明顯等弊端[4-5]。研究癌痛的致病機(jī)制，尋找控制癌痛有效可行的方法是當(dāng)前腫瘤姑息治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。Toll樣受體家族的Toll樣受體9(TLR9)是巨噬細(xì)胞識(shí)別CpGDNA的模式識(shí)別受體，它可通過(guò)激活單核/吞噬細(xì)胞系統(tǒng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化多種前炎癥細(xì)胞因子，引起急性炎性反應(yīng)。炎癥在疼痛中發(fā)揮重要作用，TLR9在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛存在，能調(diào)節(jié)下游炎性細(xì)胞因子，從而在痛覺(jué)敏化的過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究建立了大鼠脛骨癌痛模型，觀察模型癌痛動(dòng)物用電針聯(lián)合疼痛貼治療后的鎮(zhèn)痛效果及大鼠脊髓TLR9的變化情況，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇雄性SPF級(jí)SD大鼠(體質(zhì)量200～250 g)及幼鼠(60～80 g)，動(dòng)物及飼料均購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[許可證號(hào)SCXK(鄂)2015-0018]，于湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)[許可證號(hào)SYXK(鄂)2012-0067]。室溫18～20 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h晝夜循環(huán)燈照，動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行造模。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置均符合科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的規(guī)定。

1.1.2試劑與器材 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、TLR9抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、二喹啉甲酸法(BCA)試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)二抗、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、甲醇、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液購(gòu)自武漢谷歌生物公司；輻射熱測(cè)痛儀購(gòu)自上海軟隆科技公司；平衡式測(cè)痛儀購(gòu)自天津中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院生物醫(yī)學(xué)工程研究所；韓氏穴位神經(jīng)刺激儀購(gòu)自中國(guó)HANS公司；電泳儀、CFX96 TouchTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)、多色熒光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。疼痛貼由川烏、草烏、延胡索、馬錢子、徐長(zhǎng)卿、乳香、沒(méi)藥、土鱉蟲(chóng)、蟾酥、冰片及薄荷腦等中藥材碾粉，按照一定的比例混合基質(zhì)后制成藥膏，由武漢市第一醫(yī)院制劑中心提供。

1.2方法

1.2.1模型的建立及分組 Walker-256 乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)生物中心，注射至60～80 g幼鼠腹腔(4×107/mL)，接種7 d后收集癌性腹水，離心3 min(1 300 r/min)，沉淀后,用10 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,再次離心沉淀,然后以PBS重懸計(jì)數(shù),調(diào)整至適當(dāng)濃度(4×106/mL),置于冰盒內(nèi)備用。對(duì)大鼠進(jìn)行適應(yīng)性刺激，篩選出連續(xù)3 d的機(jī)械縮足閾值(MWT)≥26 g的大鼠，參照MEDHURST的方法建立脛骨癌痛模型[6-7]。腹腔注射10%水合氯酸(4 mL/kg體質(zhì)量)麻醉大鼠,用7號(hào)針頭在膝關(guān)節(jié)髕韌帶內(nèi)側(cè)緣沿脛骨縱軸往脛骨遠(yuǎn)端鉆孔,深約1 cm。然后換用微量進(jìn)樣器往脛骨骨髓腔內(nèi)注入4 μL腫瘤細(xì)胞，最后推入2 μL凝膠海綿溶液封口。另有大鼠12只，注射等量PBS后推入2 μL凝膠海綿溶液封口，作為空白組。所有注射后均留針1 min,防止注射物滲出。術(shù)后9～13 d MWT持續(xù)小于或等于8 g的大鼠視為造模成功，成模率約為50%。將造模成功的大鼠84只分為7組：模型組、針刺安慰組、膠布安慰組、聯(lián)合安慰組、電針組、疼痛貼組、聯(lián)合組，各組分籠飼養(yǎng)，做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2干預(yù)方法 空白組與模型組正常飼養(yǎng)，無(wú)特殊干預(yù)。針刺安慰組:取大鼠雙側(cè)“足三里”(ST36)與“昆侖” (BL60)穴位，用0.25 mm×13.00 mm針灸針直刺約4.00 mm，僅刺入皮下,不予通電，每次30 min。膠布安慰組:干預(yù)前24 h將大鼠背部對(duì)稱兩側(cè)用脫毛劑脫毛,脫毛面積每側(cè)為4 cm×2 cm，在脫毛處皮膚上貼敷醫(yī)用膠布。聯(lián)合安慰組：針灸針刺入大鼠穴位后,不予通電，并貼敷醫(yī)用膠布。電針組：在針刺安慰組基礎(chǔ)上連接電針，通過(guò)韓氏穴位神經(jīng)刺激儀給予“疏密波”,頻率為2 Hz/100 Hz，刺激強(qiáng)度為0.5～1.5 mA，每10分鐘遞增0.5 mA，以引起大鼠后肢肌肉輕微抖動(dòng)而不嘶叫為宜，每次30 min。疼痛貼組：在大鼠背部對(duì)稱兩側(cè)脫毛處皮膚上貼敷疼痛貼,6 h后去除藥物。聯(lián)合組：電針治療并貼敷疼痛貼。各組自造模成功后第3天起，每天干預(yù)1次，連續(xù)12 d，在干預(yù)完成后30 min內(nèi)，完成指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3取材方法 完成相關(guān)測(cè)定后處死大鼠，取出脊髓腰膨大節(jié)段，液氮凍存1周后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱凍存。

1.2.4自發(fā)性疼痛評(píng)分 將大鼠置于1.20 m×1.20 m×0.45 m的格子內(nèi),以0～3級(jí)評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠自由活動(dòng)時(shí)后肢的使用程度。0分為正常行走；1分為后肢跛行,但不是很明顯,使用正常；2分為介于1分和3分之間；3分為后肢行走時(shí)不著地。

1.2.5熱痛覺(jué)過(guò)敏測(cè)定 安靜環(huán)境中,室溫(19±1)℃,熱痛覺(jué)過(guò)敏采用輻射熱測(cè)痛儀。大鼠置于底為光滑玻璃的有機(jī)玻璃格子內(nèi),適應(yīng)20 min待大鼠安靜后,將強(qiáng)熱光束照射至大鼠腳掌中心皮膚,引起大鼠縮爪反應(yīng)的時(shí)間為大鼠縮爪潛伏期(PWL),測(cè)5次，取后3次算平均值,兩次間隔5 min。為防止大鼠熱輻射燙傷,將PWL的上限值(cut-off time)定為20 s。

1.2.6機(jī)械性痛覺(jué)超敏測(cè)定 安靜環(huán)境中,室溫(19±1)℃,適應(yīng)20 min后,根據(jù)Dixon的up-and-down法,使用von Frey細(xì)絲刺激大鼠腳掌中部皮膚,觀察大鼠縮足反應(yīng)。每根細(xì)絲每次刺激時(shí)間不超過(guò)2 s,上次刺激結(jié)束5 min后再進(jìn)行下一次刺激,計(jì)算出50% von Frey反應(yīng)閾值作為機(jī)械性痛閾值。

1.2.7RT-PCR檢測(cè)各組TLR9表達(dá) 取-80 ℃凍存的各處理組標(biāo)本，Trizol試劑法提取各組織標(biāo)本中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用特異性引物合成相應(yīng)PCR產(chǎn)物后，參照試劑盒說(shuō)明書操作。大鼠特異性引物由武漢谷歌生物科技公司合成，其序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。以GAPDH基因作為內(nèi)參，將標(biāo)本的待測(cè)指標(biāo)和內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。相對(duì)定量數(shù)據(jù)處理使用2-△△Ct法，即改變的倍數(shù)為2-△△Ct，其中，ΔΔCt=ΔCt(模型組)-ΔCt(空白組)，ΔCt=(Ct樣本-CtGAPDH)。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.2.8Western blot檢測(cè)各組TLR9表達(dá) 取-80 ℃凍存的各處理組大鼠脊髓標(biāo)本，加入組織裂解液后在冰上以電動(dòng)勻漿器勻漿。離心獲得組織蛋白提取液后以二喹啉甲酸法(BCA)法定量。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)，封閉，加入特異性抗TLR9(1∶500)和GAPDH一抗(1∶1 500)，4 ℃孵育過(guò)夜后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育1 h，磷酸鹽緩沖液吐溫20(PBST)洗滌3次后加入ELC試劑，在多色熒光凝膠成像系統(tǒng)下顯色成像。用Quantity-One圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶光密度分析，目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度的比值作為蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

2 結(jié) 果

2.1各組自發(fā)性疼痛評(píng)分比較 除疼痛貼組外，其余組均高于聯(lián)合組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白組、疼痛貼組的自發(fā)性疼痛評(píng)分低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2各組熱痛覺(jué)過(guò)敏測(cè)定比較 空白組、疼痛貼組、聯(lián)合組的PWL時(shí)間高于模型組(P<0.05)；膠布安慰組的PWL時(shí)間低于聯(lián)合組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3各組機(jī)械性痛覺(jué)超敏測(cè)定比較 空白組、電針組、疼痛貼組、聯(lián)合組的機(jī)械性痛閾值高于模型組(P<0.05)。空白組的機(jī)械性痛閾值高于聯(lián)合組(P<0.05)；針刺安慰組、膠布安慰組、聯(lián)合安慰組、電針組的機(jī)械性痛閾值低于聯(lián)合組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4各組脊髓TLR9 mRNA表達(dá)變化比較 空白組、電針組、疼痛貼組、聯(lián)合組脊髓TLR9 mRNA水平低于模型組(P<0.05)。針刺安慰組、膠布安慰組、聯(lián)合安慰組脊髓TLR9 mRNA水平高于聯(lián)合組(P<0.05)。

2.5各組脊髓TLR9蛋白表達(dá)變化比較 空白組、電針組、疼痛貼組、聯(lián)合組脊髓TLR9蛋白水平低于模型組(P<0.05)。針刺安慰組、膠布安慰組、聯(lián)合安慰組脊髓TLR9蛋白水平高于聯(lián)合組(P<0.05)。

表2 各組觀察指標(biāo)比較

a：P<0.05，與模型組比較；b：P<0.05，與聯(lián)合組比較

3 討 論

癌癥骨轉(zhuǎn)移屬中醫(yī)“骨瘤”的范疇，《內(nèi)經(jīng)》指出了疼痛的病因總綱，即“不通則痛”“不榮則痛”。近年來(lái)，中醫(yī)學(xué)以其獨(dú)特的理論體系，開(kāi)展對(duì)癌性疼痛的治療研究，取得了較為滿意的進(jìn)展[8-9]。針灸療法目前廣泛應(yīng)用于癌痛治療領(lǐng)域[10]，有研究證明電針刺激雙側(cè)“足三里”和“昆侖”穴可明顯減輕癌痛[11-12]。疼痛貼主要由具有調(diào)氣和血、疏經(jīng)通絡(luò)、化淤散結(jié)的藥物配制而成。

Toll樣受體是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，激活后會(huì)分泌疼痛產(chǎn)生和疼痛持續(xù)的炎性細(xì)胞因子。有研究表明TLR9在機(jī)體內(nèi)參與了無(wú)菌性炎癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病的發(fā)病過(guò)程[13-14]。QIN等[15]發(fā)現(xiàn)TLP9同樣在人背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中表達(dá)，并且其配體還能增加神經(jīng)元對(duì)Ca+內(nèi)流的調(diào)節(jié)，提示TLR9可能參與了疼痛的產(chǎn)生和維持。

本研究結(jié)果顯示，空白組的自發(fā)性疼痛評(píng)分結(jié)果低于模型組，PWL時(shí)間、機(jī)械性痛閾值高于模型組，提示本研究建立的脛骨癌痛模型制備成功，并能反映骨癌痛患者的部分癥狀。疼痛貼組、聯(lián)合組的自發(fā)性疼痛評(píng)分結(jié)果低于模型組，PWL時(shí)間高于模型組；電針組、疼痛貼組、聯(lián)合組的機(jī)械性痛閾值高于模型組。這些結(jié)果均提示疼痛貼、電針治療具有緩解骨癌痛大鼠疼痛的作用。

TLR9參與了疼痛的產(chǎn)生和維持過(guò)程，模型組大鼠脊髓內(nèi)的TLR9表達(dá)明顯升高，其mRNA和蛋白水平都有走向一致的表現(xiàn)，提示在脛骨癌痛中TLR9起到了一定的作用,是骨癌痛模型中疼痛產(chǎn)生和維持的機(jī)制之一。而電針組、疼痛貼組、聯(lián)合組的TLR9 mRNA與蛋白表達(dá)水平均明顯下降，提示疼痛貼、電針治療緩解骨癌痛大鼠疼痛的作用機(jī)制與降低TLR9表達(dá)有關(guān)。

綜上，本研究驗(yàn)證了疼痛貼、電針治療具有緩解骨癌痛大鼠疼痛的作用，這種作用可能與降低TLR9表達(dá)有關(guān)。本研究設(shè)置了多種安慰對(duì)照組，結(jié)果提示疼痛貼聯(lián)合電針治療骨癌痛大鼠疼痛的作用確切。值得注意的是單純的針刺安慰組并未顯示出有效的治療效果，而電針治療則顯示出確切的治療效果，提示針刺的治療效果可能與刺激強(qiáng)度相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。本研究為電針聯(lián)合疼痛貼治療骨癌痛提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為今后的深入研究提供了可行性。