姜黃素在糖基化低密度脂蛋白誘導的血管平滑肌細胞脂質聚積中的作用機制研究

鄭 偉，朱明明，陳 欣，柳 丹，白 磊，路可欣，李 珊，武福云△

(1.湖北醫藥學院附屬東風醫院綜合醫療科，湖北十堰 442000；2.湖北醫藥學院基礎醫學研究所，湖北十堰 442000；3.湖北醫藥學院藥護學院，湖北十堰 442000)

糖尿病的心血管并發癥已成為糖尿病患者致殘、致死的主要原因。長期持續的高糖血癥可使體內的低密度脂蛋白(LDL)發生非酶糖化反應，最終形成糖基化低密度脂蛋白(AGE-LDL)[1]。晚期形成的糖基化終產物(AGE)相當穩定，是一種不可逆的變化，能夠在動脈內膜下和組織細胞內蓄積。即使經過治療后，AGE水平在糖尿病患者中仍高于正常水平[2]。流行病學研究發現，在糖尿病患者的血漿中，AGE和AGE修飾的載脂蛋白B水平均明顯高于健康人，AGE-LDL的水平升高和動脈粥樣硬化(AS)、冠心病的發生和冠狀動脈的狹窄程度呈正相關[3-4]。由此可見AGE-LDL可以通過某些未知途徑促進AS的發生、發展。由于修飾后的LDL主要通過非受體代謝途徑代謝，而其中一個比較重要的靶點就是B類Ⅰ類清道夫受體(SRB1)。有研究發現，SRB1不足將導致膽固醇穩態的改變從而增加AS的風險。而SRB1表達增加則能夠促進膽固醇流出，降低脂質聚積的程度[5]。除此之外，自噬被證明在AS形成和AS的斑塊穩定中發揮重要作用。自噬是真核細胞所特有的生命現象，通過形成自噬溶酶體降解陳舊的蛋白和細胞器，回收利用有用的小分子物質從而適應自身代謝的需要，為細胞提供能量使其能夠適應各種應激和饑餓等環境[6]。脂噬屬于自噬的一種特殊形式，目前已經證實脂噬能協助溶酶體脂酶降解脂質，促進膽固醇流出[7]。因此，在一定程度上，細胞自噬能力增強將導致巨噬細胞內脂質聚積程度降低，巨噬細胞轉變成泡沫細胞的速度減慢，從而抑制AS的發生、發展過程[8]。

目前，中藥抗AS取得了較大進展，中藥有效成分對AS具有明顯的作用，而且不良反應少。姜黃素呈酸性，是從姜科類植物中提取出來的酚類物質[9]。多項研究表明，姜黃素能夠從多個位點抑制AS的發生，主要包括降血脂、抗炎、抗平滑肌細胞增殖、抗氧化等[10]。多項關于腫瘤細胞的研究發現，姜黃素可引起腫瘤細胞自噬水平升高，進而引發一定的抗癌效應[11]。姜黃素的藥理作用廣泛，但其作用的分子機制還有待于進一步闡明。本研究主要闡明姜黃素在AGE-LDL誘導的平滑肌細胞脂質聚積中作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 SRB1、自噬相關蛋白Beclin和SQSTM1/p62、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)多克隆抗體購自武漢三鷹公司，糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)單克隆抗體購自德國CST公司；自噬抑制劑3-MA購自美國Sigma公司；大鼠平滑肌細胞系A7r5購自中科院上海細胞所；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM培養基購自美國Hyclone公司；青鏈雙抗購自杭州吉諾公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司；蛋白酶抑制劑、二喹啉甲酸 (BCA) 檢測試劑盒、電化學發光(ECL)檢測試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 大鼠胸大動脈血管平滑肌細胞系A7r5在含10%胎牛血清的DMEM培養基中常規培養。調整細胞密度，將進入指數生長期的A7r5細胞接種于6孔板中，生長24 h后進行分組，分別為：空白對照組(未處理組)，AGE-LDL處理組(100 μg/mL AGE-LDL處理細胞12 h)，10 μmol/L姜黃素處理組、20 μmol/L姜黃素處理組(分別由10和20 μmol/L姜黃素聯合100 μg/mL AGE-LDL處理細胞12 h)，10 μmol/L姜黃素+3-MA處理組、20 μmol/L姜黃素+3-MA處理組(同姜黃素處理組，并加入2 mmol/L的自噬抑制劑3-MA)。

1.2.2無內毒素AGE-LDL的制備鑒定 根據文獻[4]方法，37 ℃培養箱中不斷通入無菌氮氣，將購買的未修飾的LDL(n-LDL)、0.2 mol/L葡萄糖在抗氧化劑存在的條件下孵育4周。將AGE-LDL在無內毒素的透析液中透析24 h后經過0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃分裝保存。使用TNBSA法檢測LDL被糖基化修飾的水平。瓊脂糖凝膠電泳結合蘇丹黑染色檢測AGE-LDL和n-LDL的電泳遷移率差異。所有制備的AGE-LDL和n-LDL通過內毒素檢測試劑盒檢測內毒素水平，均低于0.25 EU/mL。

1.2.3Western blot 冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞1次，用含蛋白酶抑制劑的哺乳動物全細胞M-PER裂解液200 μL裂解細胞30 min，所有操作均在冰上進行。于4 ℃以10 000×g離心10 min，收集上層液體。取部分樣品進行BCA法定量分析并調整上樣量至20 μg。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后，將蛋白質轉印至PVDF膜上。5%的牛血清清蛋白(BSA)孵育封閉后，一抗按照1∶1 000稀釋，并放置于4 ℃中孵育12 h。辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗按照1:10 000稀釋，室溫孵育2 h，使用ECL檢測試劑盒進行檢測。

1.2.4油紅O染色 將A7r5細胞接種入6孔板中制作細胞爬片。加入AGE-LDL，促進平滑肌細胞吞噬脂質最終形成泡沫細胞。棄培養基，PBS漂洗3次。6孔板內加入終濃度為4%的多聚甲醛固定細胞，孵育30 min。油紅O 染色液染色30 min后去除染液，加入60%異丙醇，鏡下觀察分色(分色時間不定，細胞著色程度決定分色時間長短)。PBS清洗后將細胞放置于倒置顯微鏡下觀察染色情況，細胞內的紅色顆粒即為蓄積的脂質。

2 結 果

2.1鑒定體外制備的AGE-LDL 經過糖化修飾的LDL較未修飾前，硫化巴比妥反應程度下降[(0.28±0.02)AUvs. (0.45±0.03)AU,P<0.05]，LDL的多個氨基酸殘基被糖基化修飾(圖1A)。凝膠電泳后蘇丹黑染色法檢測到AGE-LDL的電泳遷移率明顯增加，糖化后賴氨酸殘基所帶正電荷減少，蛋白質負電荷增加(圖1B)，且AGE-LDL僅有1條條帶表示無其他蛋白質的污染，AGE-LDL在體外制備成功。

A：AGE-LDL和n-LDL在340 nm處的吸光度(OD)值；B：瓊脂糖凝膠電泳檢測圖

2.2Western blot檢測各組SRB1蛋白 Western-blot結果顯示，與空白對照組相比，10 μmol/L和20 μmol/L姜黃素處理組SRB1蛋白的表達明顯增加(P<0.05)，并且呈現出一定的濃度依賴性(圖2A)，AGE-LDL處理組的SRBI蛋白的相對表達量為0.22±0.02，10 μmol/L姜黃素處理組SRB1蛋白的相對表達量為0.36±0.04，20 μmol/L姜黃素處理組SRB1蛋白的相對表達量為0.50±0.05,與AGE-LDL組相比，姜黃素處理組明顯上調了SRB1蛋白的相對表達量，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2B。

2.3Western blot檢測各組P-GSK3β、P-mTOR、P62和beclin蛋白 Western blot結果顯示，與AGE-LDL處理組相比，10 μmol/L和20 μmol/L姜黃素處理組能夠明顯抑制GSK3β的磷酸化水平及GSK3β的下游蛋白mTOR的磷酸化水平(P<0.05)，而總的GSK3β和mTOR的表達水平在姜黃素處理前后沒有發生明顯改變，自噬相關蛋白beclin表達明顯增加，P62的相對表達量明顯降低(P<0.05)。20 μmol/L姜黃素處理組與AGE-LDL處理組相比，beclin相對表達量大約增加了1.3倍，而p62的相對表達量約減少了2.2倍，見圖3。

2.4各組平滑肌細胞脂質聚積程度 油紅O染色實驗結果表明，與空白對照組相比，AGE-LDL處理組能夠引起血管平滑肌細胞中大量的脂質聚積(圖4A、B)，而10 μmol/L和20 μmol/L姜黃素處理組能夠明顯降低AGE-LDL引起的脂質聚積(圖4C、D)。但是3-MA處理各組姜黃素抑制脂質聚積的作用明顯減弱，見圖4E、F。

A：Western blot檢測各組SRB1蛋白相對表達量；B：各組SRB1蛋白相對表達量柱狀圖。1：空白對照組；2：AGE-LDL處理組；3：10 μmol/L姜黃素處理組；4：20 μmol/L姜黃素處理組

A:Western blot檢測各組P-GSK3β、P-mTOR、P62和beclin蛋白相對表達量；B:各組P-GSK3β、P-mTOR、P62和beclin蛋白相對表達量柱狀圖。1：空白對照組；2：AGE-LDL處理組；3：10 μmol/L姜黃素處理組；4：20 μmol/L姜黃素處理組

3 討 論

AS是發生于動脈血管內壁的慢性疾病，糖尿病人群中AS的患病率高，發病年齡呈年輕化，疾病進展快，是該人群致殘、病死的重要原因之一。高血糖能夠誘導載脂蛋白發生非酶糖化。LDL的非酶糖化主要發生于載脂蛋白B(apoB)上含有賴氨酸殘基的部位，通過多步反應最終生成 AGE-LDL[12]。流行病學研究發現，在糖尿病患者的血漿中，AGE-LDL的水平升高和AS及冠心病的發生具有正相關關系，推測原因是由于修飾的LDL激活機體的單核巨噬細胞和平滑肌細胞，誘發細胞吞噬大量的 AGE-LDL，進而導致了泡沫細胞的形成[4,13]。有研究發現，AGE-LDL的代謝并不是通過LDL受體代謝途徑，糖化后的apoB蛋白不能被LDL受體所識別進而導致血漿中AGE-LDL的水平增加，進一步導致AS[14-15]。

目前，中藥抗動脈粥樣硬化取得了較好的進展。中藥有效成分對AS具有明顯的作用，如保護血管內皮、抑制平滑肌細胞增殖、抗炎等作用，而且不良反應少，能夠明顯調節免疫作用。姜黃素在心血管系統中具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗血小板聚積及增加心肌細胞功能等作用[9-10,16]。OLSZANECKI等[17]發現姜黃素對載脂蛋白E/LDL受體 (apoE/LDLR)基因敲除鼠有抗AS的作用。2010年，KIM等[18]將姜黃素作用于高脂喂養的大鼠，與對照組血清中的脂質含量進行比較，證實姜黃素能夠明顯降低三酰甘油和膽固醇的含量并促進脂質的排出。2006年，匡雙玉等[19]研究發現姜黃素作用于泡沫化的血管平滑肌細胞后，清道夫受體蛋白SREBP-1的表達水平上升，能夠加速細胞內膽固醇、游離膽固醇和酯化的膽固醇的清除速度。2015年，本課題組的前期研究也表明姜黃素能夠促進巨噬細胞的膽固醇流出從而抑制小鼠巨噬細胞內ox-LDL引起的脂質聚積[20]，這些結果都說明姜黃素具有良好的降血脂及抗AS等作用，因此推測姜黃素在AGE-LDL誘導的動脈粥樣硬化過程中可能發揮重要作用。本研究在體外成功合成了AGE-LDL(圖1)，并且合成的AGE-LDL能夠引起血管平滑肌細胞的脂質聚積(圖4B)。AGE-LDL的代謝不能通過受體代謝途徑，因此，研究AGE-LDL的非受體代謝途徑顯得更有意義。SRB1是清除修飾后LDL的重要非受體代謝途徑。SRB1不足將導致膽固醇穩態的改變，而SRB1表達增加能夠促進膽固醇流出，降低脂質聚積的程度。本研究通過Western blot檢測了SRB1的表達水平，結果表明姜黃素能夠明顯上調SRB1蛋白水平(圖2)。除此之外，本研究發現姜黃素還能夠通過促進血管平滑肌細胞的自噬水平而抑制AGE-LDL引起的脂質聚積。自噬是通過溶酶體降解細胞內受損細胞器的過程。通過一定程度的自噬使細胞能夠適應多種有害刺激，從而降低細胞凋亡和壞死發生的水平[6,21]。基礎水平的血管平滑肌細胞自噬既可以抑制細胞增殖與遷移，又可以促進細胞的生存，降低細胞的凋亡和壞死，進而起到延緩AS發生、發展及穩定AS斑塊的作用[22]。mTOR是負性調控細胞自噬的主要通路，GSK3β能激活mTOR信號，因此抑制GSk3β信號通路能夠增強自噬水平[23]。本研究發現在平滑肌細胞中，姜黃素能夠通過抑制GSK-3β/mTOR信號通路而激活自噬，并且通過自噬抑制AGE-LDL誘導的脂質聚積水平。

綜上所述，本研究提示在AGE-LDL誘導平滑肌細胞泡沫化模型中，姜黃素能夠改善平滑肌細胞泡沫化過程中的脂質蓄積，其作用機制主要是抑制GSK-3β/mTOR途徑依賴的細胞自噬及促進SRB1的表達。本研究結果為姜黃素作為抗糖尿病AS藥物在臨床上的使用提供了理論和實驗依據。