AT1受體自身抗體調(diào)控腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病腎病發(fā)病中的機制研究

郭乃鳳，陳曉嵐，曹英杰，袁 莉，范亞平

(南通大學附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇南通 226001)

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，具有較高發(fā)病率，是全球主要健康隱患之一[1-2]，每年影響大約4.15億患者，并造成500萬患者死亡。糖尿病腎病是糖尿病后期嚴重并發(fā)癥，也是造成該疾病患者死亡的主要原因[3-4]。進一步明確糖尿病腎病的發(fā)病機制及相關(guān)通路有利于尋求治療糖尿病腎病的潛在治療靶點。AT1受體自身抗體(AT1-AA)發(fā)現(xiàn)于先兆子癇患者體內(nèi)，后被證明介導原發(fā)性腎小球疾病發(fā)生、發(fā)展，其表達增加可導致腎臟損傷[5-6]。糖尿病腎病中腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮重要作用，而AT1-AA可介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。為研究AT1-AA介導糖尿病腎病發(fā)生的通路及機制，本文探討AT1-AA對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)及CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)表達的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 選取10周齡SD大鼠，體質(zhì)量200 g。鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射，繼續(xù)高脂飼料飼養(yǎng)兩周?？贵w和STZ均購自美國Sigma公司，AT1-AA ELISA試劑盒購自英國Abcam公司；GRP78抗體、CHOP抗體，以及β-actin抗體、羊抗兔二抗、兔抗大鼠二抗和羊抗小鼠二抗均購自美國Cayman公司。

1.2方法

1.2.1造模方法 使用高脂飼料(67.7%基礎(chǔ)飼料+10.0%動物油+20.0%糖+2.0%膽固醇+0.3%食鹽)飼養(yǎng)，兩周后大鼠行單腎切除手術(shù)，并將糖尿病造模成功大鼠[空腹血糖(FBG)>7.0 mmol/L，隨機血糖大于11.1 mmol/L]進行糖尿病腎病模型的檢測。選擇FBG、腎臟肥大指數(shù)(KHI)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)水平顯著升高的大鼠進行后續(xù)實驗，即為糖尿病腎病模型組(實驗組)；選取30只正常大鼠注射AT1-AA(1×10-5mmol/L AT1-AA液)，即AT1-AA處理組，正常飲食，并于相同時間注射同等量生理鹽水；另取30只正常大鼠，于兩周后腹腔注射STZ(劑量30 mg/kg)作為陽性對照組。

1.2.2血清的采集 采用眼眶取血的方法，使用毛細針準確插入大鼠內(nèi)眥，取6 mL血液，靜置30 min后使用4 ℃低速離心機離心(3 000 r/min，10 min)，獲得血清后放置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3腎臟取樣方法 大鼠麻醉后，開腹腔取腎臟。動作輕柔，取出后于生理鹽水中沖洗，并去除脂肪及結(jié)締組織。用濾紙輕柔沾除表面水分，稱重后立即放入固定液中固定，用以切片。采用冷凍切片技術(shù)，由于腎組織較軟，水分含量高，對冷凍速度要求高，冷凍速度與組織表面積及體積有關(guān)，故需將固定好的大鼠腎臟組織切為0.2 cm組織塊后再進行切片。腎組織采用4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋、切片、HE染色，觀察腎臟病理改變。

1.2.4相關(guān)指標檢測的方法 使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清AT1-AA表達水平。取腎臟組織進行勻漿，并使用Western blot檢測大鼠腎組織GRP78及CHOP表達水平。使用電鏡技術(shù)檢測大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)改變情況。

2 結(jié) 果

2.1糖尿病腎病模型血清中FBG、KHI、TGF-β1、IGF-1表達情況 實驗組大鼠血清中FBG、KHI、TGF-β1、IGF-1水平均明顯高于陽性對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。糖尿病腎病大鼠模型構(gòu)建成功。

表1 糖尿病腎病指標檢測

2.2AT1-AA處理大鼠模型血清中FBG、KHI、TGF-β1、IGF-1表達情況 AT1-AA處理組大鼠血清中FBG、KHI、TGF-β1、IGF-1表達明顯高于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 兩組指標情況比較

a：P<0.01，與陽性對照組比較

2.3大鼠腎組織切片光鏡影像 實驗組和AT1-AA處理組大鼠腎臟出現(xiàn)病理性肥大；觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)變化，兩組腎小球同樣出現(xiàn)病理性肥大增生(圖1、2)。與陽性對照組大鼠相比，實驗組大鼠和AT1-AA處理組大鼠腎臟質(zhì)量及腎質(zhì)量/體質(zhì)量比值均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

2.4大鼠腎臟組織GRP78及CHOP表達情況 實驗組和AT1-AA處理組腎臟組織GRP78及CHOP水平均增高，兩組與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

A：陽性對照組；B：實驗組；C：AT1-AA處理組

表3 3組大鼠腎肥大指數(shù)的比較

a：P<0.05，與陽性對照組比較

A：陽性對照組；B：實驗組；C：AT1-AA處理組

A：各組CHOP表達情況；B：各組CHOP表達情況的柱狀圖；C：各組GRP78表達情況；D:各組GRP78表達情況的柱狀圖

3 討 論

隨著生活水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)和生活習慣發(fā)生很大改變，患糖尿病等代謝性疾病的患者越來越多，且具有明顯年輕化趨勢[7-8]。糖尿病腎病是糖尿病晚期并發(fā)癥，是糖尿病患者死亡的主要原因之一[9]，嚴重影響患者的生存質(zhì)量及生命健康。進一步研究糖尿病腎病的發(fā)病機制，有利于發(fā)現(xiàn)治療的潛在靶點及藥物。

AT1-AA是導致原發(fā)性腎小球變病的主要因素，研究表明，糖尿病腎病患者存在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)異?；罨F(xiàn)象[10-12]，而RAS參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生、發(fā)展過程[13-15]。提示AT1-AA可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而導致糖尿病腎病的發(fā)生。GRP78、CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路兩個重要相關(guān)分子。

本文即針對AT1-AA是否通過GRP78、CHOP通路誘導腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而造成糖尿病腎病進行研究。結(jié)果顯示，與正常大鼠相比，糖尿病腎病大鼠出現(xiàn)腎臟病理性肥大、腎小球肥大、腎小球硬化等。向正常大鼠靜脈注射人工合成AT1-AA后，大鼠同樣出現(xiàn)腎臟病理性肥大，腎小球水腫、肥大、結(jié)構(gòu)改變及缺失等現(xiàn)象。這說明AT1-AA是誘發(fā)糖尿病腎病出現(xiàn)的重要因素。為進一步探討AT1-AA的作用機制及信號通路是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，本研究對正常大鼠及糖尿病腎病大鼠腎臟GRP78及CHOP蛋白表達情況進行檢測，結(jié)果表明，與正常大鼠相比，糖尿病腎病大鼠腎臟組織內(nèi)GRP78及CHOP蛋白表達均明顯增加；且向正常大鼠靜脈注射人工合成AT1-AA后，正常大鼠腎臟組織內(nèi)GRP78及CHOP蛋白同樣出現(xiàn)表達增加現(xiàn)象，進一步證明了AT1-AA通過該通路發(fā)揮腎臟損傷作用。

綜上所述，糖尿病個體中AT1-AA通過調(diào)節(jié)GRP78、CHOP信號通路，增加腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而誘導糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。