一個共同性外斜視家系基因突變研究

李永蓉，王 慧

(安徽省合肥市第二人民醫院眼科 230011)

斜視是指由于各種原因所致眼外肌作用不平衡，眼位偏斜的一種眼科常見疾病，分為共同性斜視和非共同性斜視。在亞洲人口中，共同性外斜視最常見[1]，影響兒童視力發育、雙眼融合功能和立體視，目前發病原因尚未明確。共同性外斜視具有較高的遺傳性，MATSUO等[2]報道，共同性外斜視遺傳性表現為多種基因遺傳，并有一些敏感的染色體位點。非共同性外斜視中的先天性眼外肌纖維化(CFEOM)是一種特殊的家族性遺傳疾病，為單基因遺傳。有研究發現共同性外斜視與非共同性外斜視CFEOM有相似的遺傳基因突變可能性，ARIX基因突變與CFEOM2有關[3]，最新研究發現 TUBB3基因、細胞形態TUBB2b基因與CFEOM3有關[4]，本研究在共同性外斜視家系中同時檢測ARIX、TUBB2b、TUBB3基因，探討ARIX、TUBB2b、TUBB3基因在共同性外斜視遺傳中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者1，女，46歲；患者2，男，41歲。兩例患者為同父母姐弟，2014年7月因共同性外斜視來本院行手術治療。經追查發現一個完整共同性外斜視家系，患者母親年輕時患有外斜視，已手術矯正。兩例患者各有1名女兒患有共同性外斜視(隱斜)，暫保守觀察。所有患者及家系為健康人，均足月順產，無低出生體質量、無吸氧史、無傳染病史，排除家系其他疾病及遺傳性疾病史。

1.2方法

1.2.1試驗取材 本研究通過本院醫學倫理委員會評估(批準號：201439)，遵循赫爾辛基宣言，征求患者及家屬同意并簽署知情同意書后，抽取1名正常親屬外周靜脈血，標記為1號，抽取4例患者外周靜脈血，分別標記為2、3、4、5號。1、2、4號為親姐弟3人，其中2、4號為共同性外斜視患者并行斜視矯正手術；3、5號分別為4、2號女兒，患有共同性外隱斜，暫不需治療。5人間有血緣關系，采取標本送ARIX基因突變檢查，并繪制家系圖譜(圖1)。另抽取其他3名無血緣關系健康人外周靜脈血作為陰性對照，分別標記為6、7、8號，和上述5個標本一起送TUBB2b基因、TUBB3基因突變檢查。所有標本采取后存放于-80 ℃的冰箱中保存，OMEGA試劑盒，PCR擴增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.2試驗方法 通過對家系患者外周血基因組DNA提取、引物合成及PCR擴增、純化產物測序，進行該家系患者ARIX基因、TUBB2b基因及TUBB3基因與Genbank公布的基因正常序列比對。試驗方法分為基因組DNA提取，引物設計及PCR擴增，測序3步進行。

1.2.2.1基因組DNA提取 外周血液DNA的提取：采用E.Z.N.A.?血液DNA微量提取試劑盒(Omega公司，美國)，按照說明書提取DNA后測量基因組DNA的濃度和光密度(OD)值(Nanodrop 2000,Thermofish公司，美國)。提取的DNA取2 μL進行電泳檢測。基因組DNAOD260/OD280值為1.72～2.01，濃度為40～75 ng/μL，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示條帶單一，基因組DNA于-80 ℃保存。

表1 ARIX基因、TUBB2b基因、TUBB3基因外顯子引物序列

1.2.2.2引物設計及PCR擴增 設計引物分別擴增ARIX基因、TUBB2b基因及TUBB3基因外顯子區域。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，PCR擴增引物見表1。PCR擴增反應體系為20 μL，包括1 μL模板DNA(10～60 ng/μL)，10 μL Takara 2×PCR Premix(RR003A)，1 μL引物(2.5 pmol/μL)，9 μL ddH2O。使用ABI公司的9700 PCR儀進行PCR反應。ARIX基因反應程序：95 ℃ 5 min，(94 ℃ 45 s ，59 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s)×40個循環，72 ℃ 10 min 終止反應。TUBB2b基因反應程序：95 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s)×40個循環，72 ℃ 10 min終止反應。TUBB3基因反應程序：95 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)×40個循環，72 ℃ 10 min終止反應。PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶均單一。擴增產物按照PCR產物回收試劑盒(OMEGA D2500-01)說明書的操作步驟進行回收純化。

1.2.3測序 PCR產物經過瓊脂糖檢測有目的條帶后，由奧美德諾(北京)基因科技有限公司進行切膠純化雙向測序。測序PCR的條件為：預變性96 ℃ 30 s，95 ℃變性 30 s，退火溫度50 ℃ 30 s，60 ℃延伸4 min,25個循環后，最后60 ℃延伸5 min，16 ℃結束反應，純化后上3730xl (BigDye Version3.1,美國應用生物系統公司，美國)遺傳分析儀器進行測序。應用DNASTAR軟件分析，并與Genebank進行比對。

2 結 果

2.1ARIX基因測序結果 與GenBank中公布的人野生型ARIX基因序列比較，本研究篩查的家系中患者2、3、4、5號在ARIX基因熱點突變區域NM_005169.3:c.156C>T (p.Leu52=);c.215C>T (p.Ala72Val);c.217+19C>A沒有出現突變，見圖2。

圖2 ARIX基因熱點突變區域突變情況

2.2TUBB2b基因測序結果 與GenBank中公布的人野生型TUBB2b基因序列比較，本研究篩查的家系中2號患者在TUBB2b基因外顯子rs2259136位點發生同義突變，見圖3。

圖3 TUBB2b 基因外顯子rs2259136位點基因型

2.3TUBB3基因測序結果 與GenBank 中公布的人野生型TUBB3基因序列比較，本研究篩查的家系中2、4、5號患者在TUBB3基因3′UTR rs1135425位點存在基因突變，見圖4。

圖4 TUBB3基因3′UTR rs1135425位點基因型

3 討 論

共同性外斜視是一種常見的斜視類型，早期表現為外隱斜、間歇性外斜視，最后發展為恒定性外斜視。常發病于幼兒，早期表現不容易被家長所識別，一旦外斜視從間歇性轉變為恒定性，即使手術治療，恢復雙眼單視與立體式的可能性也較小。臨床上常見的治療方式是手術治療，許多患兒因為多種原因發展到恒定性外斜視時才接受手術治療，嚴重影響視功能。因此，對共同性外斜視的發病機制的研究至關重要。

共同性外斜視具有遺傳性，國外有研究提出了一些敏感性位點，但無明確的基因定位，日本學者調查了55個共同性斜視家庭(n=258)，進行全基因MOD評分法分析，發現在一些敏感染色體4q28.3和7q31.2位點區域，有來源于父親或母親的遺傳現象[5]。GONG等[6]通過研究一對母女都患有間歇性外斜視的患者，在配對基因PAX3中發現了1種新的雜合突變(c.G434T)。ZHANG等[7]研究表明MGST2和WNT2是日本患者共同性外斜視敏感性的候選基因。

共同性外斜視發病有家族聚集性特點，LEE等[8]研究發現在兄弟姐妹中有一對患有斜視時，共同性外斜視的發病年齡、屈光狀態、臨床特征、斜視的亞型都是相同的，也證明了共同性外斜視的遺傳特性。MATSUO等[9]研究孿生兄弟或姐妹患有共同性斜視病例中，單卵雙生子或三胞胎斜視表現一致性最常見，達84%，雙卵雙生或多卵三胞四胞胎的斜視表現一致性較低，其中間歇性外斜視為主要表現形式。

研究表明共同性外斜視的遺傳是一個多因素方式，包括遺傳和環境因素，最主要的危險因素有早產兒、低出生體質量、早產兒視網膜病變、母親孕期吸煙、遠視和屈光參差、遺傳因素等[10]。BAGHERI等[11]研究發現，近親結婚發生共同性外斜視比例比非近親結婚高。

CFEOM是一種少見的常染色體顯性遺傳性眼肌疾病，臨床上主要表現為動眼神經缺陷引起的斜視。趙堪興[12]提出CFEOM的發生和KIF21A這種驅動蛋白不能輸送動眼神經軸突、神經肌肉接頭和眼外肌發育所需物質有關，這種斜視是由支配眼球運動的顱神經發育異常導致。OUYANG等[13]研究發現共同性外斜視患者大腦的幾個區域腦白質體積明顯降低，動眼神經傳導異常。2007年劉桂香等[14]發現共同性外斜視的1個突變基因——ARIX基因位于染色體11q13上，由3個外顯子組成，編碼1個同源結構域翻譯因子，對交感神經和與眼位控制有關的腦干運動神經元亞群的傳代和生存起關鍵作用。本研究這個家族性共同性外斜視家系，并沒有發現患者有ARIX基因外顯子的任何突變。

ARIX基因突變與CFEOM2有關，CFEOM表現為先天性上瞼下垂和外斜視，外斜視眼球運動受限可能是由于在運動蛋白KIF21A或tubulin等類型的TUBB3或TUBB2b中雜合子錯義突變引起的[15]。這些基因突變會改變蛋白質的功能，導致運動神經元軸突生長和引導缺陷。日本學者 NAKANO等[16]通過研究4個CFEOM2家系,對這些家族成員進行基因測序和突變篩查,發現該家系ARIX/PHOX 2 A 基因的3個純合子突變與發病密切相關。CFEOM的3種遺傳形式被定義為CFEOM1、CFEOM2和CFEOM3。CFEOM2是一種由轉錄因子PHOX2A中純合突變引起的神經元規范的常染色體隱性障礙，而CFEOM1和CFEOM3是軸突誘導的常染色體顯性障礙，分別由KIF21A和TUBB3或TUBB2b的雜合突變引起[17]。

通過進一步檢測本研究這個家系患者的TUBB2b 基因的外顯子，發現2號患者在rs2259136位點有同義突變，雖并未引起氨基酸改變，但該位點rs2259136首次在共同性外斜視患者中發現，其意義值得進一步研究。本家系中2、4、5號3例共同性外斜視患者，在TUBB3基因中發現3′UTR區域rs1135425位點突變，3′UTR具有轉錄調節功能，可與miRNA或RNA結合影響mRNA的穩定性，進而影響基因的轉錄及翻譯，本研究推斷3′UTR區域rs1135425位點改變可能是引起該家系外斜視的病因。

對于共同性外斜視遺傳性來說，闡明特定的基因突變仍然是一個巨大的挑戰，大多數學者認為其遺傳性是由遺傳和環境多因素影響的。隨著新興的基因組測序工具的使用，學界可能會產生新的見解，現在斜視的遺傳性研究也開始有從研究斜視肌肉分子組成、調控基因表達方向進行的，AGARWAL等[18]研究發現斜視肌的分子組成發生了實質性的改變。未來還會有更多新的研究方向產生，本研究發現的基因突變位置可能是未來研究的基礎，了解這些基因突變的作用有助于了解目前尚不清楚的發病機制，這也是本課題組臨床研究工作開展的目的。