GSK-3β和E-cadherin在子宮內膜腺癌中的表達和意義

李家平，何 濤，袁紅瑛

(1.河南科技大學第一附屬醫院婦科,河南洛陽 471003；2.河南科技大學臨床醫學院，河南洛陽 471003)

近20年子宮內膜癌發病率呈逐年上升趨勢，且逐漸向年輕人群邁進[1-3]，在歐美發達國家其發病率高居生殖系統腫瘤首位[4]。子宮內膜癌的發病原因，機制目前尚無明確定論，給治療帶來諸多困難。近年來人們認為Wnt信號通路的上游分子糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)可能影響腫瘤細胞的形成、遷移和自我更新，起著促進細胞程序性死亡，限制細胞增殖，發揮負性調控行為[5-6]。SOKOLOSKY等[7]研究顯示GSK-3β在胃癌組織中陽性表達水平較正常胃組織明顯下調。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)在正常微環境中起著維持細胞之間結構的穩定性，防止它們隨意遷移、黏附，其表達水平降低易導致上皮-間質轉化事件發生。許多研究顯示E-cadherin下調與上皮腫瘤關系密切，在口腔癌[8]、乳腺癌等上皮癌中E-cadherin表達較正常組織明顯下調。腫瘤的形成、進展涉及微環境的變化和細胞內部結構的改變等繁雜的程序[9]，本研究試圖應用免疫組織化學技術，檢測GSK-3β和E-cadherin在子宮內膜腺癌中的表達情況，旨在分析該基因與子宮內膜腺癌的關系，有助于子宮內膜腺癌的治療，為臨床預后提供參考，現報道如下。

A:正常增殖期內膜組(SP×200);B:子宮內膜不典型增生組(SP×200)；C：子宮內膜腺癌組(SP×100)

圖1 3組GSK-3β的表達

1 資料與方法

1.1一般資料 本試驗86例標本來自2010年1月至2012年12月河南科技大學第一附屬醫院婦科手術切除子宮內膜組織，分為正常增殖期內膜組(12例)，子宮內膜不典型增生組(19例)和子宮內膜腺癌組(55例)。采用免疫組織化學SP技術探測GSK-3β、E-cadherin在3組標本中表達情況。參照國際婦產科聯盟規定的手術病理分期，18例Ⅲ～Ⅳ期和37例Ⅰ～Ⅱ期子宮內膜腺癌標本，其中17例淋巴結被癌細胞浸潤。納入標本的患者術前未進行放化療、激素治療，且無其他惡性腫瘤，切除標本被病理證實。納選標本均按免疫組織化學試驗要求制作。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學SP法 試劑：兔抗人GSK-3β單克隆抗體(美國Abcam公司)，試驗濃度1∶200；兔抗人E-cadherin單克隆抗體(中國福建邁新公司)工作液，試驗依照免疫組織化學SP-0023試劑盒(美國ZYMED公司)說明書步驟進行。

1.2.2免疫組織化學結果判定 GSK-3β陽性表達位于細胞質或細胞核,E-cadherin陽性表達位于細胞膜或細胞質。依據著色深淺和陽性細胞比例分析評定，a是著色水平：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；b是陽性細胞比例：陰性為0分，<1/4為1分，1/4～3/4為2分，>3/4為3分；統計a+b之和：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為陽性(++)，>4分為強陽性(+++)。本研究陽性等級依照+～+++標準。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0 軟件進行數據分析，計數資料以頻數或百分率表示，比較采用χ2檢驗或Fisher精準性檢驗分析，Spearman秩和法進行相關性分析，Kaplan-meier法進行生存分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1GSK-3β和E-cadherin在子宮內膜不同病變中的表達

2.1.1GSK-3β表達 3組均可見GSK-3β表達，陽性表達主要定位于細胞質，表現為棕褐色、棕黃色、黃色，見圖1。GSK-3β在正常增殖期內膜組、子宮內膜不典型增生組、子宮內膜腺癌組中陽性率分別為83.3%、78.9%、36.4%，3組比較差異有統計學意義(χ2=15.640，P=0.000)。子宮內膜不典型增生組GSK-3β表達水平較子宮內膜腺癌組顯著增高(χ2=10.273，P=0.001)，較正常增殖期內膜組差異無統計學意義(P=1.00)，正常增殖期內膜組GSK-3β表達水平較子宮內膜腺癌組明顯增高(χ2=8.789，P=0.003)，見表1。

表1 GSK-3β在3組組織中的比較[n(%)]

2.1.2E-cadherin表達 3組均可見E-cadherin表達，陽性表達主要定位細胞膜，表現為棕褐色、棕黃色、黃色，見圖2。E-cadherin在正常增殖期子宮內膜組、子宮內膜不典型增生組、子宮內膜腺癌組中陽性率分別為91.7%、73.7%、21.8%，差異有統計學意義(χ2=28.959，P=0.000)。子宮內膜不典型增生組GSK-3β表達水平較子宮內膜腺癌組顯著增高(χ2=16.669，P=0.000)，較正常增殖期內膜組差異無統計學意義(P=0.363)，正常增殖期內膜組GSK-3β表達水平較子宮內膜腺癌組顯著增高(χ2=18.333，P=0.000)，見表2。

A:正常增殖期內膜組(SP×200);B:子宮內膜不典型增生組(SP×200)；C：子宮內膜腺癌組(SP×100)

圖2 3組E-cadherin的表達

2.2GSK-3β和E-cadherin的表達與子宮內膜腺癌臨床病理特征的關系 GSK-3β在FIGO分期標準：Ⅲ～Ⅳ期、Ⅰ～Ⅱ期陽性表達率分別為16.7%，45.9%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。E-cadherin陽性表達率在低分化組、中分化組，高分化組分別為9.1%、9.4%、66.7%，3組比較差異有統計學意義(P<0.05)；高分化組和中分化組比較及高分化組和低分化組比較差異有統計學意義(P<0.05)，中分化組和低分化組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。隨著腫瘤侵犯組織范圍的擴大，GSK-3β的陽性表達率明顯減弱，差異有統計學意義(P<0.05);E-cadherin的陽性表達率減弱，差異無統計學意義(P>0.05)；隨著病理分級的增高，GSK-3β的陽性表達率減弱，而差異無統計學意義(P>0.05)；但E-cadherin的陽性表達率呈明顯減弱趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)。而GSK-3β和E-cadherin的表達與癌細胞浸潤子宮肌層深度、是否轉移到淋巴結、患者的年齡無明顯相關性(P>0.05)，見表3。

表3 GSK-3β和E-cadherin的表達和子宮內膜腺癌的臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3子宮內膜腺癌中GSK-3β和E-cadherin表達的關系 相關性采用Spearman等級分析顯示GSK-3β和E-cadherin表達呈正相關(r=0.516,P=0.000)，見表4。

2.4子宮內膜腺癌中GSK-3β和E-cadherin蛋白表達與預后 納入55例子宮內膜癌，從手術后病理證實日期開始至2017年12月，隨訪36例，中途有3例患者因其他疾病死亡，2例患者未復發。經Log-rank檢驗，GSK-3β陽性表達組臨床預后較陰性組好，E-cadherin陽性表達組臨床預后較陰性組好，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3、4。

表4 GSK-3β和E-cadherin在子宮內膜腺癌中的表達水平關系(n)

圖4 E-cadherin的表達與子宮內膜腺癌臨床預后的Kaplan-meier分析

3 討 論

Wnt/GSK-3β信號通路是用來調控細胞增殖、細胞極性及控制細胞命運的基礎通路。通路關閉時，GSK-3β與相關蛋白形成復合物抑制β-catenin入細胞核，從而阻止了細胞的癌變過程。GSK-3β由于具有“β”折疊的N端和“α”螺旋的C端結構域，因此擁有獨特的磷酸化，亞細胞定位和GSK-3β結合蛋白之間的相互影響，協助在體內實現精準調控。磷酸化GSK-3β氨基端的絲氨酸(Ser9)導致其失活，Wnt等信號通路可磷酸化此位點，而磷酸化GSK-3β酪氨酸位點(Tyr216)導致其被激活。因此，GSK-3β與相關蛋白形成復合物后通過各個途徑或規避或促進腫瘤的形成。胡福清[10]研究發現GSK-3β被激活可以抑制乳腺癌干細胞擴增，失活型GSK-3β可以導致乳腺癌細胞系MCF-7的耐藥，同樣高表達持續激活型GSK-3β可以抑制乳腺癌的成瘤[11-13]；而梁爽爽[14]的研究發現，GSK-3β可抑制凋亡，認為腫瘤中可能存在如下機制：GSK-3β過度表達促使Wnt/β連環蛋白通路下游信號分子WISP-1過度表達，進而使半胱天冬酶(caspase)-3表達受抑，導致癌細胞增殖。本研究表明GSK-3β在正常和不典型增生子宮內膜呈高表達，而在子宮內膜腺癌呈低表達，提示可能是在癌組織中GSK-3β氨基端的一個絲氨酸(Ser9)磷酸化后其活性被抑制，導致GSK-3β與相關蛋白形成的復合物崩解，β-catenin逃逸被磷酸化而在細胞質集聚并入核，本研究發現在子宮內膜癌組織中，隨著分期增加，陽性表達逐漸降低；隨著病理分級的增高，淋巴結的轉移，陽性表達有下降趨勢，進一步論證試驗的推測：入核后的β-catenin促進靶基因的轉錄，促進細胞增殖、轉移，提示GSK-3β的低表達在腫瘤進行性發展中，扮演重要生物學角色，預兆著腫瘤的侵襲力和惡性程度。但對于腫瘤早期診斷有局限性，可能需要擴大樣本量進一步進行研究驗證。

人類E-cadherin基因定位于16q22.1，主要分布于上皮細胞，與細胞骨架、β-catenin等連接形成復合體，與周圍的組織細胞相互辨別、黏附，形成特定的組織[5]，其表達降低易導致細胞剛性改變，進而變性、游走、定植，從而導致腫瘤細胞侵襲能力增強。在乳腺腫瘤、消化道腫瘤、泌尿系腫瘤中，E-cadherin基因的突變或減弱均被檢測到。本研究結果顯示E-cadherin在正常和非典型增生子宮內膜呈現高表達，而在子宮內膜腺癌顯示低表達，隨著病理分級的增高呈明顯下降趨勢(P<0.05)，隨著浸入肌層深度的增加、腫瘤分期的增高和淋巴結的轉移，陽性表達也降低，更進一步驗證試驗推測：入核后的β-catenin結合LEF/TCF轉錄因子家族，啟動下游基因轉錄，轉錄因子反過來抑制E-cadherin表達，導致細胞膜E-cadherin降低，一方面降低細胞極性、黏附性，觸發上皮-間質轉化事件，腫瘤細胞發生浸潤、轉移；另一方面，與細胞膜上E-cadherin蛋白結合的β-catenin從細胞骨架蛋白肌動蛋白附著處游離，在細胞質集聚，激活Wnt信號通路，進一步加劇上皮-間質轉化現象。在本研究55例子宮內膜癌中，GSK-3β和E-cadherin有10例共為陽性，33例共為陰性，說明它們在子宮內膜癌的發生、發展中有相互協同作用。Wnt/GSK-3β信號如何與E-cadherin黏附復合物相互作用知之甚少，仍然需要大量的研究進行論證闡釋，

綜上所述，GSK-3β和E-cadherin的低表達，可能相互促進β-catenin在細胞質內穩定性并募集入核，一方面與相關蛋白相互作用規避細胞凋亡，另一方面結合E-cadherin啟動子部位的E-box，促使E-cadherin的功能減弱而觸發上皮-間質轉化現象，癌細胞逃逸監管四處遷移增殖，導致腫瘤轉移、復發。本試驗采用Spearman等級相關分析，GSK-3β和E-cadherin表達呈正相關。通過隨訪觀察，采用Kaplan-meier分析，發現子宮內膜癌GSK-3β和E-cadherin陽性表達患者臨床預后較好而陰性表達者較差，兩者在子宮內膜癌的發生、發展中可能起著既獨立又協同的作用。通過手術后對標本進行聯合檢測，有利于臨床醫生對腫瘤的生物學特性準確判斷、指導治療和預后評估。