急性心肌梗死并心力衰竭患者血清miR-132和miR-31水平及其臨床診斷價值研究

田煥平，吳海波，劉惠良，白世茹，王學超，杜榮品△

(1.河北省人民醫院心內六科，石家莊 050000；2.河北醫科大學研究生院，石家莊 050000)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠狀動脈粥樣硬化使血管狹窄或阻塞，常由不穩定斑塊糜爛及破裂誘發，造成一過性或持續性阻塞，從而引起的心肌損傷或壞死[1]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是一種炎癥性疾病，由粥樣硬化斑破裂，誘發局部血栓形成，出現心肌缺血綜合征[2-5]。微小RNA(microRNA，miRNA)能調控轉錄水平后的基因翻譯[6]。miRNA的5′端的核苷酸能與靶miRNA 3′-UTR區域互補，對下游靶基因產生調控[7]。miR-132可通過阻斷蛋白激酶B(protein kinase B，PKB) 信號通路抑制心血管內皮細胞增殖和集落形成[8]。miR-31對細胞 DNA 的復制起始和增殖具有重要作用[9]。本研究擬探討AMI并心力衰竭患者血清miR-132和miR-31水平及其臨床診斷的價值，并與傳統的AMI并心力衰竭評價指標超敏C-反應蛋白(hs-CRP)、N 末端 B 型利鈉肽原(NT-proBNP)進行相關性分析，為AMI并心力衰竭的早期診斷及治療提供理論及實踐基礎，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年7月至2016年8月河北省人民醫院心內科確診的80例AMI患者為病例組，其中男40例，女40例，年齡43～73歲,平均(59.8±13.4)歲,其中ST段抬高型心肌梗死54例，非ST段抬高型心肌梗死26例。選取同期76例門診健康體檢者作為對照組，其中男36例，女40例，年齡46～70歲，平均(58.7±12.7)歲，對照組均無既往肺栓塞病史、惡性腫瘤、6周內手術史、下肢外傷史、心功能不全、腦血管意外、長期臥床等病史。所有對象均簽署知情同意書。納入標準：(1)患者經臨床癥狀、心電圖、冠狀動脈造影明確診斷，符合《2010年急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》，以及符合《2012年非 ST 段抬高急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南》的高危患者；(2)AMI發病小于24 h；(3)初中以上文化水平；(4)既往無精神障礙史，可自由交流和溝通；(5)有一定的生活自理能力，意識清晰。排除標準：(1)孕婦或近3個月有手術、創傷史；(2)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病以外的其他心臟病；(3)肝、腎功能不全者；(4)嚴重高血壓未控制(≥180/110 mm Hg)、心源性休克、糖尿病酮癥、呼吸道疾病、周圍血管性疾病或栓塞性疾病者。

1.2方法

1.2.1儀器及試劑 貝克曼AU-480全自動生化分析儀(美國庫爾特公司)、德鐵HBS-1096B酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒(碧云天生物技術公司產品)、miR-132、miR-31基因的表達測定采用μLtraSYBR One Step RNA PCR Kit(寶生物工程大連有限公司)、實時熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)、NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀(美國Thermo公司)、恒溫培養箱grp-9080(美國通用公司、超凈工作臺(上海恒躍醫療器械有限公司)。hs-CRP、NT-proBNP ELISA試劑盒購于上海恒遠生物科技有限公司,三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒為Syemex-i2000全自動血細胞分析儀、貝克曼AU-480全自動生化分析儀原廠自帶試劑。

1.2.2實驗步驟 病例組及對照組患者清晨空腹及肱靜脈抽血；取靜脈血10 mL置于無菌管中，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，分離血清，AU-480全自動生化分析儀測定TG、HDL-C、LDL-C，德鐵HBS-1096B酶標儀測定hs-CRP、NT-proBNP。剩余血清用于測定miR-132、miR-31基因的表達，參照GenBank數據獲取2個基因多態性位點的序列，設計待測基因位點的PCR擴增引物和單堿基延伸引物，按20 μL模板和 50 μL反應液構成 PCR反應體系，擴增程序:95 ℃ 5 min;93 ℃ 10 s，61 ℃ 30 s，重復40個循環，61 ℃時采集熒光，反應體系為：5 μL 2×μL traSYBR One Step RT-qPCR Buffer、0.4 μL正向引物,10 μmol/L、0.4 μL反向引物,10 μmol/L、0.2 μL SuperEnzyme Mix、0.6 μL RNA Template、3.4 μL Rnase-Free Water。實時熒光定量PCR儀檢測其表達水平，見表1。

表1 β-actin、miR-132、miR-31引物序列

2 結 果

2.1兩組一般情況比較 兩組在性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒、高血壓、高脂血癥等一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組一般情況比較

續表2 兩組一般情況比較

2.2兩組miR-132、miR-31指標比較 病例組miR-132表達水平低于對照組，miR-31表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組miR-132、miR-31指標比較

2.3兩組血脂指標比較 病例組HDL-C水平低于對照組，TG、LDL-C水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩組血脂指標比較

2.4兩組hs-CRP、NT-proBNP水平比較 病例組hs-CRP、NT-proBNP水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 兩組hs-CRP、NT-proBNP水平比較

2.5miR-132、miR-31與各指標相關性分析 miR-132與HDL-C，miR-31與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP呈正相關關系(P<0.05)；miR-132與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP，miR-31與HDL-C呈負相關關系(P<0.05)，差異有統計學意義(P<0.05)，見表6。

2.6ROC曲線及靈敏度、特異度分析 受試者工作特征曲線提示，miR-31+miR-132、miR-31、miR-132 ROC曲線下面積(AUC)為0.832(0.799，0.893)，0.801(0.758，0.868)，0.793(0.735，0.852)；miR-31、miR-132兩者的AUC相近，皆小于miR-31+miR-132；miR-31、miR-132診斷急性心肌梗死并心力衰竭的靈敏度、特異度相近(χ2=1.219、1.695，P>0.05)，皆小于miR-31+miR-132(χ2=16.249、17.023，P<0.05)，均具有一定診斷準確性，見表7、圖1。

表6 miR-132、miR-31與各指標相關性分析

表7 ROC曲線及靈敏度、特異度分析

A:miR-31+miR-132;B:miR-31;C:miR-132

圖1 miR-31+miR-132、miR-31、miR-132的ROC曲線

3 討 論

miRNA是一種具有高度進化保守性的非編碼小RNA，其在調控細胞的基因表達方面有極其重要的作用，在腫瘤的發生、發展中也扮演著重要的角色[10]。miRNA可通過與下游靶基因的3′-非翻譯區相結合，參與細胞增殖、分化、及信號轉導等過程[11]。研究發現，miR-31蛋白可介導細胞的定向轉移和趨化性，并激活淋巴細胞、內皮細胞、中性粒細胞、上皮細胞上相應的趨化因子受體[12]。遺傳基因學發現miR-31過表達是引發大部分自身性炎性反應的主要原因，高度表達miR-31蛋白的淋巴細胞株增殖能力明顯高于野生株[13]。高表達miR-31蛋白的淋巴細胞可分泌更多的白細胞介素(IL)-8及血管內皮生長因子(VEGF)，而IL-8、VEGF在炎癥的形成過程中發揮重要作用[14-15]。此外miR-31還可致使血管內皮嚴重損傷，膠原組織暴露，組織因子釋放，刺激血小板附著和聚集，從而激活凝血反應鏈，導致纖維蛋白及免疫球蛋白也應激增高，形成高凝狀態和纖溶亢進，進一步誘發AMI及心力衰竭的發生[16]。miR-132具有組織特異性，在癌癥、神經退行性病變、免疫系統疾病中也發揮重要作用[17]；也可能促進動脈粥樣硬化，參與內皮細胞中脂肪的生成和膽固醇的合成[18]。miR-31的作用機制與miR-132相反，研究表明miR-31與胚胎的發育有關，能直接下調Nodal蛋白家族中的squint蛋白，還能調控Nodal蛋白的抑制劑letfy[19]。

目前與心力衰竭相關miRNA的表達及功能研究主要集中在動物模型上，較少在臨床患者中研究。因此本研究設計從臨床角度探討心肌梗死后心力衰竭患者血清miR-31、miR-132的表達水平及其意義。本研究結果顯示，病例組miR-132表達水平低于對照組，而miR-31水平高于對照組；病例組HDL-C水平低于對照組，TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP水平均高于對照組，且兩組間差異有統計學意義(P<0.05)。miR-132與HDL-C及miR-31與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP呈正相關；miR-132與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP及miR-31與HDL-C呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05)；說明AMI并心力衰竭患者血清miR-132水平降低，miR-31水平升高；診斷AMI并心力衰竭時，miR-31、miR-132兩者的AUC相近，皆小于miR-31+miR-132，且AUC均具有一定的診斷準確性。說明miR-132、miR-31及miR-31+miR-132對于AMI并心力衰竭有一定的診斷價值，以miR-31+miR-132組合最佳。

綜上所述，AMI并心力衰竭患者血清miR-132、miR-31與miR-31+miR-132具有一定的診斷價值，以miR-31+miR-132組合最佳。