恥垢分枝桿菌中反式翻譯報告體系的構建

胡亞文，白嘉誠，葛文雪，姚夢依，張雪蓮

復旦大學生命科學學院遺傳工程國家重點實驗室， 上海 200433

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)引起的慢性傳染病。盡管過去幾十年結核病防治工作取得了重大進展，但結核病仍是全球頭號傳染病殺手。2018年世界衛生組織全球結核病報告顯示，2017年全球有 1 000 萬人患結核病，160萬人死于結核病，且耐多藥結核病對公共衛生安全的威脅越發嚴峻。因此，探索抗結核藥物作用新靶點，研發新型抗結核藥物顯得尤為重要。

核糖體拯救途徑對細菌拯救熄火核糖體(也叫非終止核糖體復合物)至關重要，主要包括由tmRNA-SmpB 介導的反式翻譯途徑及ArfA和ArfB分別介導的兩種替代途徑[1-3]。反式翻譯是絕大多數細菌體內存在的主要核糖體拯救途徑[4]，其作用機制是當mRNA在核糖體上翻譯突然終止時，由ssrA基因編碼的tmRNA中的開放讀碼框(open reading frame，ORF)被嵌入到核糖體解碼中心的密碼子缺失位置，此時以tmRNA作為mRNA而恢復翻譯過程，直到ORF末端的終止密碼子處終止，最終釋放的蛋白因含有ssrA基因的標簽肽序列而被ClpXP、Lon等蛋白酶識別并水解[5-8]。當反式翻譯過程失活或表達受到抑制時，有些細菌如大腸埃希菌會啟動由ArfA(YhdL)或ArfB(YaeJ)介導的核糖體拯救途徑[9-13]。然而，迄今為止在結核分枝桿菌中沒有發現能替代反式翻譯這一拯救途徑的因子。已有研究表明，tmRNA 及其結合蛋白SmpB在結核分枝桿菌中均為必需基因[14-15]，反式翻譯過程對結核分枝桿菌的生長及其生理功能的調控發揮著重要作用。例如，抗結核重要藥物丙嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)可抑制結核分枝桿菌的反式翻譯途徑而達到殺菌目的[16-17]。因此，深入探究反式翻譯在結核分枝桿菌中的功能及將其作為靶點研發新型抗結核藥物具有重要意義。

為快速探究反式翻譯在分枝桿菌中的表達及功能特點，本研究以快生長的恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis，M.smegmatis，Msm)為實驗菌株，選取mCherry和egfp作為報告基因，成功構建了能在恥垢分枝桿菌中反映反式翻譯動態表達水平的報告體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質粒大腸埃希菌(DH5α)、恥垢分枝桿菌為本實驗室保存菌株，pMV261穿梭質粒為本實驗室保存質粒。

1.1.2試劑PrimeSTAR HS DNA Polymerase、工具酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ均購自TaKaRa公司，T4 DNA連接酶購自New England Biolabs公司，瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購自Axygen公司，Middlebrook 7H9和7H10購自BD公司，BCA蛋白定量試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司，ECL Prime Western Blotting Detection Reagent購自GE Healthcare公司。其他試劑均為實驗室常用分析純試劑。

1.1.3引物設計為使菌株能表達非成熟錯誤蛋白，設計引物時，在報告基因3′端缺失終止密碼子的情況下添加大腸埃希菌終止子序列(表1中的下劃線序列)，來誘導mRNA非成熟的轉錄終止。以下所有標寫mCherry-T和EGFP-T名稱的基因，均為在報告基因末端添加了終止子序列而設計的啟動基因。所有引物均由上海睿迪生物科技有限公司合成，設計序列詳見表1。

1.2 方法

1.2.1重組表達載體的構建mCherry、mCherry-T、EGFP、EGFP-T目的基因分別用引物對mCherry F/mCherry R、mCherry F/mCherry-T R、EGFP F/EGFP R、EGFP F/EGFP-T R進行擴增。獲得4種目的基因的聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)產物，純化，進行BamHⅠ和HindⅢ 酶切，于含有T4 DNA 連接酶的體系中分別與BamH Ⅰ和HindⅢ 雙酶切后的pMV261質粒載體片段進行連接。將連接產物轉化至大腸埃希菌(DH5α)感受態細胞，在含50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板上篩選陽性克隆，通過BamHⅠ和HindⅢ 雙酶切鑒定和DNA測序驗證陽性克隆中插入基因的正確性。將正確的重組質粒分別命名為pMV261-mCherry、pMV261-mCherry-T、pMV261-EGFP和pMV261-EGFP-T。

表1 PCR引物設計

1.2.2恥垢分枝桿菌感受態細胞的制備及轉化挑取恥垢分枝桿菌單菌落于7H9-OADC液體培養基中培養至對數期，收集菌體用于制備感受態細胞。將純化后的pMV261-mCherry、pMV261-mCherry-T、pMV261-EGFP、pMV261-EGFP-T質粒電轉至制備好的恥垢分枝桿菌感受態細胞中，電轉復蘇后涂布于含有20 μg/mL卡那霉素抗性的7H10-OADC固體平板中，37 ℃孵育3 d，挑取恥垢分枝桿菌重組菌株。

1.2.3重組恥垢分枝桿菌菌體顏色觀察分別挑取重組恥垢分枝桿菌Msm∷mCherry和Msm∷mCherry-T單菌落，于7H9-OADC液體培養基(含20 μg/mL卡那霉素)中培養至對數期，分別取50 mL菌液離心，收集菌體，去除上清液后觀察菌體顏色并拍照記錄。

1.2.4重組恥垢分枝桿菌中EGFP的表達分析分別挑取重組恥垢分枝桿菌Msm∷EGFP和Msm∷EGFP-T單菌落，于7H9-OADC液體培養基(含20 μg/mL卡那霉素)中培養至對數期，離心收集菌體。超聲碎菌后，于4 ℃，13 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA蛋白定量法計算蛋白濃度。分別取30 μg的Msm∷EGFP和Msm∷EGFP-T蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，電泳后取一塊膠用考馬斯亮藍染色液染色，另一塊進行蛋白免疫印跡檢測。以EGFP標記的鼠單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的羊抗鼠IgG作為二抗，增強化學發光法(enhanced chemiluminescence, ECL)鑒定EGFP的表達。

1.2.5報告體系在恥垢分枝桿菌中的動態表達將4種菌株接種于7H9-OADC培養基，培養至對數期，按1%的比例分別重新轉接至50 mL 7H9-OADC新鮮培養基中。以mCherry作為報告基因的實驗菌株于培養15、21、40、45 h時分別收集菌體并觀察顏色變化；以egfp作為報告基因的實驗菌株于培養15、21、30、40 h時分別收集菌體，按 1.2.4 所述方法定量檢測Msm∷EGFP和Msm∷EGFP-T兩種菌株中的EGFP表達量。

2 結果

2.1 恥垢分枝桿菌反式翻譯報告體系的構建及表達

2.1.1mCherry和EGFP表達載體的構建將重組質粒pMV261-mCherry和pMV261-mCherry-T分別進行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，理論上應該出現大小為 4 680 bp的大片段及711 bp和736 bp的小片段。電泳結果顯示，實際獲得的大、小片段與理論一致(圖1A)。同樣，陽性重組質粒pMV261-EGFP和pMV261-EGFP-T經BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后，電泳獲得 4 680 bp的大片段及717 bp和742 bp的小片段(目的基因)(圖1B)。對測序結果進行分析，可看到pMV261-mCherry-T和pMV261-EGFP-T兩種重組質粒測序圖譜C端比對照質粒多了GCAGCCCGCCTAATGAGCAGC-GGGCTTTTTT這一段大腸埃希菌終止子序列。結果與預期一致，表明4種質粒均構建成功(圖1C、圖1D)。

2.1.2重組質粒在恥垢分枝桿菌中的表達將測序成功后的4種重組質粒分別電轉至恥垢分枝桿菌感受態細胞，挑取卡那霉素抗性的單克隆菌落，于7H9-OADC培養基中培養至OD600=0.8。采用菌體顏色變化和蛋白免疫印跡法分別檢測mCherry和egfp兩種報告基因在恥垢分枝桿菌中的表達情況。結果顯示，pMV261-mCherry和pMV261-mCherry-T兩個重組菌株因mCherry紅色熒光蛋白的表達，最終使菌體呈現紅色，但pMV261-mCherry-T 菌株顏色比pMV261-mCherry的顏色淺(圖2A)。蛋白免疫印跡法定量檢測EGFP表達水平時，發現EGFP-T的蛋白條帶比EGFP正常表達的蛋白相對分子質量略大，且前者蛋白水平明顯低于后者(圖2B、圖2C)。這一方面是基于細菌體內反式翻譯作用原理，即在不成熟的mRNA出現時，細菌會啟動反式翻譯途徑，并將翻譯出的目標蛋白標簽上ssrA的氨基酸序列，從而使蛋白相對分子質量略變大[18]。另一方面，帶有終止子序列的mCherry和egfp基因在表達過程中，因啟動反式翻譯過程促進了錯誤蛋白的水解，使得蛋白水平比正常表達時要低。上述結果提示，啟動分枝桿菌反式翻譯體系的重組菌株Msm∷mCherry-T和Msm∷EGFP-T構建成功。

2.2 恥垢分枝桿菌中反式翻譯報告體系的動態表達

比較Msm∷pMV261-mCherry與Msm∷pMV261-mCherry-T在不同生長時間內的顏色變化(圖3A)及Msm∷pMV261-EGFP與Msm∷pMV261-EGFP-T菌體中EGFP表達水平(圖3B)，分別觀察mCherry-T和EGFP-T兩種報告體系在恥垢分枝桿菌生長不同階段的動態表達特點。

結果表明，當mCherry在恥垢分枝桿菌中正常表達時，隨著培養時間延長，mCherry紅色熒光蛋白在細菌體內逐漸積累，使得細菌顏色(紅色)逐漸加深；而當mCherry-T在恥垢分枝桿菌中錯誤表達時，與mCherry正常表達相比，在細菌培養的任一階段，菌體顏色均較正常要淺，表明錯誤表達的紅色熒光蛋白在菌體內部被部分水解。從mCherry-T在恥垢分枝桿菌中的自身表達來看，細菌生長從15 h到21 h菌體顏色有加深的趨勢，而從21 h到45 h菌體顏色逐漸變淺。蛋白免疫印跡法定量結果顯示，重組菌株中非成熟的EGFP表達水平在生長任一階段均比正常表達的EGFP水平低，且錯誤表達的EGFP與錯誤表達的mCherry一樣，在生長至對數期時錯誤蛋白含量最高，對數期后反式翻譯過程的參與導致大量錯誤蛋白被水解而逐漸降低，并于40 h后完全水解。上述結果進一步證實了恥垢分枝桿菌中反式翻譯報告體系的成功構建，且細菌體內反式翻譯進程是一個動態變化的過程，當蛋白出現翻譯異常時，細菌可立即啟動反式翻譯途徑。同時，當細菌生長到達對數生長期，隨著錯誤蛋白的積累，反式翻譯過程也更加強烈并可快速將錯誤蛋白水解，以確保細菌的正常生長及生理功能。

A: Cell color of Msm∷pMV261-mCherry and Msm∷pMV261-mCherry-T at different growth stages. Tubes 1, 3, 5 and 7 represent Msm∷pMV261-mCherry. Tubes 2, 4, 6 and 8 represent Msm∷pMV261-mCherry-T. B: The expression levels of EGFP in Msm∷pMV261-EGFP and Msm∷pMV261-EGFP-T at different growth stages.

3 討論

細菌反式翻譯的作用是將停滯在mRNA上熄火的核糖體釋放，以保證蛋白質的正常翻譯和穩定表達，進而保障細菌的正常生長及生理功能。此外，反式翻譯還能參與調控細菌對壓力環境的脅迫反應。研究發現，大腸埃希菌tmRNA 缺陷體在熱激、氧化還原、饑餓等壓力條件下均表現出生存能力下降的狀態[19]，表明大腸埃希菌反式翻譯在細菌應對壓力環境中具有重要調控作用。同時，人們發現很多核糖體抑制劑可提高 tmRNA 的表達水平，如利用紅霉素處理恥垢分枝桿菌時，會導致tmRNA前體(pre-tmRNA)和成熟 tmRNA 增加[20]，由此推測 tmRNA 表達增強是細菌受抗生素脅迫時的重要應激反應。

反式翻譯作為結核分枝桿菌中的核糖體拯救途徑，其調控對結核分枝桿菌的生長及生理功能至關重要。近年來一線藥物PZA通過抑制反式翻譯途徑發揮抗結核作用機制的發現，使得該途徑成為研究抗菌藥物作用靶點的新方向[16-17]。因此，反式翻譯途徑的深入研究對探討結核分枝桿菌潛伏感染、新藥研發等有十分重要的意義。

基于結核分枝桿菌中ssrA和smpB均為必需基因這一特點[14-15]，利用傳統基因敲除的方法來研究反式翻譯的功能變得更為艱難。因此，構建一種能引起細菌體內反式翻譯表達及研究其特點的報告體系，有望從側面探究反式翻譯在分枝桿菌中的作用。本研究利用缺失終止密碼子的mRNA會使核糖體熄火這一特點，分別以mCherry和egfp作為報告基因，成功構建了能誘導啟動分枝桿菌反式翻譯途徑的體系。兩種報告體系可分別從菌體顏色變化和蛋白定量水平來展示反式翻譯啟動過程。反式翻譯報告體系的成功構建，不僅可用于后續深入探究分枝桿菌中反式翻譯的功能，還可作為以反式翻譯途徑為靶點的抗結核藥物的篩選平臺。