一株亞硝化細菌的分離鑒定及其發酵工藝優化

趙彭年, 楊德玉, 王加友, 丁一凡, 安 鵬, 王 遠

沈陽化工研究院有限公司生物與醫藥研究所, 沈陽 110021

亞硝化細菌(又稱氨氧化菌)在自然界中分布十分普遍，其在土壤、淡水及海洋中都有存在。亞硝化細菌對環境的變化等較為敏感[1]，其通過氧化水中的氨氮作為唯一能量來源以維持自身生長需要，以碳酸鹽為碳源、以氨氮為氮源來合成細胞所需物質，是典型的自養型細菌。其代謝氨氮氧化反應式為2NH3+3O2=2HNO2+2H2O[2,3]。亞硝化細菌生長緩慢，平均生長代時在10 h以上[4]，且其不能在有機培養基中生長，對營養的專一性較強，從而使得其分離和擴大培養較為困難。

亞硝化細菌在污水氨氮降解過程中發揮著重要作用，是脫氮過程中的限速反應步驟，在污水處理研究中，利用亞硝化細菌進行氨氮去除及氨氮短程硝化的應用越來越多[5,6]，但多數停留在菌株分離、搖瓶培養的階段，而在發酵罐中進行高密度發酵的研究報道相對較少。此外，在污水處理前期需要投加較多的亞硝化細菌進行氨氮的有效降解，然而由于亞硝化細菌的高密度發酵較為困難，且產量較少，目前只有少數外資企業掌握相關技術，使得亞硝化細菌菌劑的市場價格較高，嚴重影響了亞硝化細菌在污水處理過程中的應用。基于此，本研究將沿海污泥富集培養后，通過硅膠平板和水洗瓊脂平板分離得到1株亞硝化細菌并命名為Sys NC-02，通過搖瓶培養、正交試驗對其培養條件和培養基組分進行優化，利用10 L發酵罐進行高密度發酵并進一步優化發酵工藝，以期對其后續工業化生產起到重要的指導作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1培養基 亞硝化細菌富集培養基：0.5% Na2CO3、0.4% (NH4)2SO4、0.1% K2HPO4、0.005% MgSO4、0.2% NaCl，加蒸餾水至1 L，混勻溶解，調節pH至8.0。

亞硝化細菌硅膠平板分離培養基：在亞硝化細菌富集培養基的基礎上加入硅膠[7]。

亞硝化細菌水洗瓊脂平板分離培養基：在亞硝化細菌富集培養基的基礎上加入水洗瓊脂[7]。

1.1.2主要儀器設備 ZWYR-D2402型搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)、T100型PCR擴增儀(Bio-RAD)、BIOTECH-10BGZA型發酵罐(上海保興生物設備有限公司)、Cleverchem380型水質分析儀(德國DeChem-Tech公司)、HQ30d型便攜式溶氧測定儀(美國HACH公司)。

1.2 檢測方法

1.2.1氨氮的測定方法 水楊酸比色法[8]。

1.2.2亞硝態氮(即亞硝酸鹽)的測定方法 N-(1-萘基)-二乙胺光度法[8]。

1.2.3亞硝化速率測定的方法 在研究過程中發現，亞硝化細菌在靜止的發酵液中沉降速度較快，若利用分光光度計測量其OD值，結果重現性較差；而采用MPN計數法[9]則存在計數時間長、計數干擾因素多等問題，不利于試驗的快速進行。基于陳金聲和史家梁[10]的亞硝化速率測定方法、陳捷音[11]的亞硝化細菌檢測方法，以及亞硝化細菌氧化氨氮為零級反應[12]的理論依據，選擇通過測定發酵液的亞硝化速率來表示發酵液中的亞硝化細菌的數量及活性。

①用單位時間生成亞硝態氮的量測定亞硝化速率。取某發酵時段發酵液10 mL加入裝有190 mL的亞硝化細菌培養基的1 L三角搖瓶中，于30℃、180 r/min搖床培養，每隔0.5 h取樣，以開始培養的時間點作為零點，利用Cleverchem 380分析儀測量亞硝態氮的濃度，以亞硝態氮的濃度為縱坐標、培養時間為橫坐標作圖，得到的斜率乘以稀釋倍數(20倍)就是此時段的亞硝化速率。

②用單位時間消耗氨氮的量測定亞硝化速率。取某發酵時段發酵液10 mL加入裝有190 mL的亞硝化細菌培養基的1 L三角搖瓶中，于30℃、180 r/min搖床培養，每隔0.5 h取樣，以開始培養的時間點作為零點，利用Cleverchem 380分析儀測量氨氮的濃度，以氨氮的濃度為縱坐標、培養時間為橫坐標作圖，得到的斜率乘以稀釋倍數(20倍)就是此時段的氨氮氧化速率。由于單位時間內的氨氮大多數被轉化為亞硝態氮，所以可以用此方法間接計算亞硝化速率。

1.3 亞硝化細菌的分離鑒定

1.3.1亞硝化細菌的分離 將取自大連海水灣的污泥樣品加入含有200 mL富集培養基的1 L三角揺瓶中，于30℃、180 r/min搖床培養，直到體系中氨氮全部降解并有亞硝態氮累積。

吸取0.5 mL富集培養液，均勻涂布在硅膠平板上，于30℃恒溫培養。待硅膠平板上長出針尖大小的菌落后，挑取硅膠平板上多個單菌落并分別在瓊脂平板上劃線，于30℃恒溫培養。再挑取瓊脂平板上的菌體分別接入含有20 mL亞硝化細菌富集培養基的100 mL三角揺瓶中，于30℃、180 r/min搖床培養，并于培養過程中檢測發酵液中的亞硝態氮濃度，選取可不斷生成亞硝態氮的菌株繼續培養，當亞硝化細菌在揺瓶中生長到一定濃度后靜置沉降，向濃縮的菌液加入等體積的50%甘油，分裝于菌種管內于-70℃保存。

1.3.2亞硝化細菌的鑒定 利用收集的亞硝化細菌菌體提取菌株基因組DNA，以提取的DNA為模版，以5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAACG-3′、5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′為引物，進行PCR擴增。PCR 反應體系(50 μL)：DNA 模板1 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，1 mmol/L引物各1 μL，10×Loading Buffer 5 μL，5 U/μLTaq酶0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。擴增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 60 s， 72℃ 2 min，共30個循環；72℃ 10 min。將擴增產物交至蘇州金唯智生物科技有限公司測序，將測序結果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫BLAST中進行序列對比，利用MEGA 7.0軟件以Neighborjoining法繪制系統發育樹，并將菌株命名為Sys NC-02。

1.4 亞硝化細菌氨氮去除能力考察

將新分離獲得的亞硝化細菌Sys NC-02與本實驗室原有的1株亞硝化細菌Nitrosomonassp. HPC101進行對比，以考察Sys NC-02的氨氮去除能力。

分別吸取Sys NC-02和HPC101的培養液接種于含有亞硝化細菌富集培養基的揺瓶中，通過調整接種體積使2種亞硝化細菌在揺瓶內的亞硝化速率相同，同時放入搖床中培養(30℃、180 r/min)。每隔0.5 h取樣，48 h后，檢測發酵液中氨氮含量并計算氨氮去除率，同時通過測定亞硝態氮濃度來計算亞硝化速率，進而考察2種亞硝化細菌的氨氮去除能力及生長能力。

1.5 亞硝化細菌培養條件的優化

1.5.1溫度、pH、溶解氧濃度對亞硝化細菌的影響 最適溫度確定：將Sys NC-02菌液分別接種于6個含有亞硝化細菌富集培養基(pH 8.0)的1 L三角瓶中，分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下，180 r/min搖床培養。最適pH確定：分別向pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的5個含有亞硝化細菌培養基的1 L三角瓶中接種Sys NC-02菌液，于最適溫度、180 r/min搖床培養。最適溶解氧濃度確定：將Sys NC-02菌液分別接種于7個含有亞硝化細菌培養基(最適pH)的1 L三角瓶中，在最適溫度下，分別以80 r/min、100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min進行搖床培養，并用溶氧儀測量發酵液的溶解氧濃度。上述處理均需每隔0.5 h取樣，測量發酵液中的亞硝態氮的濃度，通過比較計算得到的亞硝化速率大小來確定培養亞硝化細菌Sys NC-02的最適溫度、pH和溶解氧濃度。

1.5.2亞硝態氮濃度對亞硝化細菌的影響 分別向含有亞硝態氮濃度為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L、1 500 mg/L、2 000 mg/L的亞硝化細菌富集培養基(最適pH)的1 L三角揺瓶中接種Sys NC-02菌液，在最適溫度下，于120 r/min搖床培養。每隔0.5 h取樣，測量發酵液中氨氮的濃度，通過計算得到的氨氮氧化速率大小確定發酵過程中亞硝態氮(即亞硝酸鹽)累積對亞硝化細菌Sys NC-02的影響。

1.6 亞硝化細菌發酵培養基的優化

1.6.1培養基組分單因素實驗 最適碳源篩選：在不含Na2CO3的亞硝化細菌富集培養基中分別加入0.5%的Na2CO3、NaHCO3、CaCO3，每個處理3次重復，在最優培養條件下進行培養，考察不同碳源對Sys NC-02生長的影響。最適碳源作為下一步實驗用碳源。最適氮源篩選：在不含(NH4)2SO4的亞硝化細菌富集培養基中分別加入0.4%的(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl，每個處理3次重復，在最優培養條件下進行培養，考察不同氮源對Sys NC-02生長的影響。最適氮源作為下一步實驗用氮源。最適磷酸鹽篩選：在不含K2HPO4的亞硝化細菌富集培養基中分別加入0.1%的K2HPO4、KH2PO4、NaH2PO4，每個處理3次重復，在最優培養條件下進行培養，測定不同磷酸鹽對Sys NC-02生長的影響。最適磷酸鹽作為下一步實驗用磷酸鹽。最適微量元素篩選：在不含MgSO4的亞硝化細菌富集培養基中分別加入0.005%的MnSO4、FeSO4、MgSO4，每個處理3次重復，在最優培養條件下進行培養，測定不同微量元素對Sys NC-02生長的影響。

1.6.2培養基組分正交試驗 根據1.6.1的結果，選定培養基中4個營養組分，設計4因素3水平試驗，各因素的試驗水平見表1。在最優培養條件下進行培養，通過比較不同處理的亞硝化速率大小來對培養基中各成分的含量進行調整。

1.6.3污水處理效果對比 分別向優化培養基和原培養基中接種相同體積的Sys NC-02菌液，于最優培養條件下進行培養，48 h后將2種培養基中的Sys NC-02菌液以相同的接種量分別接種至含有氨氮污水的三角揺瓶中，于30℃、180 r/min搖床中培養。每12 h取樣，檢測污水中氨氮含量并計算氨氮去除率，進而驗證培養基優化后亞硝化細菌對污水的處理效果。

表1 正交設計因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test.

1.7 亞硝化細菌10 L發酵罐小試生產條件優化

利用10 L發酵罐進行高密度發酵，以優化小試生產條件。利用亞硝化細菌在發酵液中靜止后易沉降及其在發酵過程中不需要絕對無菌的特點，以新鮮培養基對亞硝化細菌發酵過程中的發酵液進行置換，以降低發酵液中亞硝態氮(即亞硝酸鹽)的濃度，從而大幅降低亞硝酸鹽對亞硝化細菌的生長抑制作用以實現亞硝化細菌的高密度發酵。

在亞硝化細菌發酵后期，亞硝態氮濃度累積到抑制濃度(即該濃度對亞硝化細菌的生長產生抑制作用)之前，停止攪拌和通氣，使亞硝化細菌沉降30 min，然后吸走發酵上清液，保留的發酵液體積為原體積的1/3，再補加新鮮培養基至原體積，開啟攪拌及通氣繼續發酵。當亞硝態氮濃度再次累積到抑制濃度時繼續進行發酵液置換，置換的次數由發酵罐的供氧能力和亞硝態氮再次到達抑制濃度的時間來決定。

1.8 數據分析

采用Microsoft Excel 2013軟件對數據結果進行處理與作圖，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行差異顯著性檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

然后我發現他們誰也沒有把我這句話聽進去，我把這句話說了好幾遍，到頭來只有我一個人聽進去了。這時候我打算離開了，我心想不能再這么混下去了，我們從原先那個家搬到這個新的家里來，都有一個星期了，我每天都在這里整理、整理的，滿屋子都是油漆味和灰塵在揚起來。我才二十四歲，可我這一個星期過得像個忙忙碌碌的中年人一樣，我不能和自己的青春分開得太久了，于是我就站到廚房和書房的中間，我對我的父母說：“我不能幫你們了，我有事要出去一下。”

2 結果與分析

2.1 菌株分離鑒定

將海洋污泥富集培養后，經硅膠平板和水洗瓊脂平板分離得到單菌落的亞硝化細菌，其在水洗瓊脂平板培養基上形成的菌落較小、呈圓形、周邊光滑、油狀、半透明。生物顯微觀察顯示其細胞體呈短桿狀、表面光滑，革蘭氏染色為陰性。

將測得的16S rDNA基因序列通過GenBank進行Blast比對，利用MEGA 7.0軟件以Neighborjoining法繪制系統發育樹。如圖1所示，菌株Sys NC-02與Nitrosomonaseuropaeastrain C-31菌株的同源性為100%，初步確定Sys NC-02屬于亞硝化單胞菌Nitrosomonassp.。

2.2 菌株氨氮去除能力

將Sys NC-02菌株與本實驗室原有的1株亞硝化細菌Nitrosomonassp. HPC101進行對比，由表2可知，新分離得到的亞硝化細菌Sys NC-02的氨氮去除率和生長能力都具有較為明顯的優勢，具有進一步研究的價值。

圖1 亞硝化細菌的同源性分析Fig.1 Homology analysis of nitrite bacteria.

菌株初始亞硝化速率[mg(N-NO-2)/L·h]最終亞硝化速率[mg(N-NO-2)/L·h]氨氮去除率Sys NC-023.25.878.2%Nitrosomonas sp.HPC1013.24.353.5%

2.3 亞硝化細菌培養條件的優化

2.3.1最適溫度 在不同溫度條件下培養Sys NC-02，并測量發酵液中亞硝態氮的濃度，進而計算相應的亞硝化速率。由圖2可知，15℃時，亞硝化速率幾乎為零；隨著溫度升高，亞硝化速率逐漸升高，30℃時，亞硝化速率達到最大值；而后，隨著溫度升高，亞硝化速率逐漸降低。由此可推測，溫度過高或過低時都會影響亞硝化細菌氨氧化酶的活性，從而影響亞硝化速率的大小。因此，培養亞硝化細菌Sys NC-02的最適溫度為30℃。

圖2 溫度對亞硝化細菌的影響Fig.2 The effect of temperature on nitrite bacteria.

2.3.2最適pH 在不同pH條件下培養Sys NC-02，并測量發酵液中亞硝態氮的濃度，進而計算相應的亞硝化速率。一般認為亞硝化細菌的最適pH為7.5～8.5。從圖3可以看出，pH為8.0時，亞硝化速率最大；pH低于8.0時，亞硝化速率呈遞減趨勢；pH高于8.0時，亞硝化速率急劇下降，這可能是在pH為8.5時，游離氨濃度的增加抑制了亞硝化細菌的生長代謝[13,14]。由此可知，培養亞硝化細菌Sys NC-02的最適pH為8.0。

2.3.3最適溶解氧濃度 亞硝化細菌屬于好氧菌，發酵液中的溶解氧在其生長過程中起著重要作用。在30℃、pH 8.0的條件下，將Sys NC-02置于不同轉速的搖床中進行培養，用溶氧儀測量發酵液中的溶解氧濃度，同時，測量發酵液中亞硝態氮的濃度，進而計算相應的亞硝化速率。

圖3 pH對亞硝化細菌的影響Fig.3 The effect of pH on nitrite bacteria.

由圖4可知，最初亞硝化細菌的亞硝化速率隨著溶解氧濃度的升高而增大；當轉速大于120 r/min、溶解氧濃度高于1.8 mg/L時，亞硝化速率趨于穩定，不再隨溶解氧濃度的升高而增大。這說明溶解氧濃度≥1.8 mg/L時即可滿足亞硝化細菌的生長需求。因而，從經濟方面考慮，在發酵過程中保持溶解氧濃度≥1.8 mg/L是較為合適的。

圖4 溶解氧濃度對亞硝化細菌的影響Fig.4 The effect of dissolved oxygen concertration on nitrite bacteria.

圖5 亞硝態氮濃度對亞硝化細菌的影響Fig.5 The effect of nitrite concentration on nitrite bacteria.

2.4 亞硝化細菌發酵培養基的優化

2.4.1單因素實驗 以亞硝化細菌富集培養基為基礎，利用不同的碳源、氮源、磷酸鹽和微量元素，考察不同組分對亞硝化細菌生長的影響。由圖6可知，通過4組單因素實驗及差異顯著性分析結果(P<0.05)可以確定，最優培養基組合：碳源為NaHCO3、氮源為(NH4)2SO4、磷酸鹽為KH2PO4、微量元素為FeSO4。

2.4.2正交試驗 根據上述單因素實驗篩選結果，NaHCO3、(NH4)2SO4、KH2PO4、FeSO4分別為最適碳源、氮源、磷酸鹽和微量元素。將各因素做正交試驗，選用正交表L9(34)進行正交設計(表3)，以優化亞硝化細菌發酵培養基組分。

由表3可知，4種因素對亞硝化細菌生長的影響大小：(NH4)2SO4>NaHCO3>KH2PO4>FeSO4。同時，發酵培養基中最佳組合為A2、B3、C2、D2，即亞硝化細菌最佳培養基組成為0.5% NaHCO3、0.8% (NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.01% FeSO4。

圖6 不同組分對亞硝化細菌亞硝化速率的影響Fig.6 The effects of different media on nitrosation rate of nitrite bacteria.注:不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

編號因素A:NaHCO3B:(NH4)2SO4C:KH2PO4D:FeSO4最終亞硝化速率[mg(N-NO-2)/L·h]111114.1212226.8313338.1421235.8522316.36231211.1731324.8832136.19332110.2K16.3334.9007.1006.867K27.7336.4007.6007.567K37.0339.8006.4006.667R1.4004.9001.2000.900

注：R為系列因素的極差，其絕對值大小代表不同因素對亞硝化細菌生長的影響程度，R越大，影響程度越大，反之亦同。Ki為不同因素不同水平所對應試驗指標之和的平均值，選擇較大的Ki值所對應的水平作為該因素的最佳水平，即若某因素的K2>K1，則選擇水平2作為該因素的最佳水平。

2.4.3污水處理效果對比 分別向優化培養基和原培養基中接種相同體積的Sys NC-02菌液，于最優培養條件下進行培養，再以相同的接種量分別接種于含有氨氮污水的三角揺瓶中，以驗證培養基優化后亞硝化細菌對污水的處理效果。由圖7可知，處理36 h后，優化培養基組對氨氮的降解效果顯著優于原始培養基組(P<0.05)。說明培養基優化后，Sys NC-02單位體積的發酵液活性有了較大提高。

2.5 亞硝化細菌10 L發酵罐小試生產條件優化

圖8 優化條件發酵數據曲線Fig.8 The data curves of optimized fermentation conditions.

圖9 進行2次發酵液置換的發酵曲線Fig.9 The data curves for performed twice fermentation broth replacements.

3 討論

本研究將沿海污泥富集培養后，通過硅膠平板和水洗瓊脂平板分離得到1株亞硝化細菌并命名為Sys NC-02，通過搖瓶培養確定其最優培養條件：最適溫度為30℃、最適pH為8.0、最適溶解氧濃度≥1.8 mg/L，與已有研究結果[17～21]基本一致。并通過培養基組分的單因素實驗和正交試驗確定了最佳的培養基組合及濃度：0.5% NaHCO3、0.8% (NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.01% FeSO4。優化培養基培養的Sys NC-02對污水中氨氮的去除率顯著高于原始培養基，說明優化培養基可較好的促進Sys NC-02的生長，同時提高了其單位體積的活性。

為了在微生物發酵過程中通過控制發酵液中生成物的濃度，以減少其對微生物生長的抑制作用，常用的可行途徑為2種。一種是以指數流加為代表的流加方法，通過控制發酵過程中底物的濃度以降低副產物的生成累積對細菌生長的抑制[23]，這種方法比較適用于大腸桿菌、酵母菌等的高密度發酵，此類生物的共同特性是其獲取能量的反應速度與反應物的濃度有關，通常在一定濃度范圍內，濃度越大細菌生長速度越快，副產物累積也越快，對微生物生長的抑制作用也越大。而亞硝化細菌的代謝屬于生物反應中較為特殊的零級反應，亞硝酸鹽的生成速度在一定條件下與氨氮濃度無關。因此，流加類方法不適用于亞硝化細菌的發酵。

另一種方法是在發酵過程中通過利用新鮮培養基置換一部分發酵液的方法，將發酵產物濃度控制在一定范圍內，降低發酵產物的濃度對生物生長的抑制作用，從而實現高密度發酵，如目前在細胞培養中較為流行的灌流法[24,25]采用的就是這一原理，此類方法可以保證細菌或細胞不隨置換液流失，又可以降低發酵液中代謝產物的累積，較好的促進了微生物或細胞的生長。當然此類方法只適用于在發酵液中沉降性較好的微生物和用微載體進行培養的貼壁細胞。

需要注意的是，本研究雖然利用灌流培養的方式實現了亞硝化細菌的高密度發酵，但為了控制亞硝酸鹽濃度，整個發酵過程需要人工長期值守且需要較為頻繁的檢測，增加了人力物力成本，所以此發酵方式還需進一步優化。今后主要研究方向是通過發酵實驗數據的累積建立氨氮的加入量與亞硝酸鹽生成量的數據模型，通過數據模型計算出亞硝酸鹽的累積濃度，從而減少檢測頻率；并以數據模型為依據對發酵設備硬件和軟件進行改造，爭取實現亞硝化細菌在無人值守下的自動發酵，為亞硝化細菌工業化生產提供技術支持。