棉花GhCAD6基因表達及其功能分析研究

胡文冉, 李曉東, 周小云, 李曉榮, 楊 洋, 李 波

1.新疆農業科學院核技術生物技術研究所, 新疆農作物生物技術重點實驗室, 烏魯木齊 830091;2.新疆維吾爾自治區水產科學研究所, 烏魯木齊 830000

新中國成立以來，我國棉花(Gossypiumhirsutum)產量和品質都得到了大幅度的提高。但還存在著纖維比強度偏低及纖維品質諸指標搭配不合理等問題，難以滿足國內外市場和紡織工業的多種需求[1]。新疆作為我國最大的優質棉生產基地也存在著同樣的問題，嚴重影響著我國棉花在國際上的競爭力[2]。由于缺乏優異種質和親本材料，所以在常規育種方面棉花纖維品質改良效果并不明顯。目前棉花纖維改良的途徑已從常規育種轉向常規育種與生物技術育種相結合，其中轉基因研究是棉纖維品質改良的一個重要方面。

棉花纖維是由胚珠外珠被表皮層的單細胞分化發育而成，在發育過程中主要經歷纖維原始細胞分化和突起、纖維細胞的伸長、次生壁增厚和棉纖維脫水成熟4個階段[3]。棉花纖維發育過程也是其纖維品質形成的過程。棉花纖維品質的主要恒定指標包括纖維長度、比強度、馬克隆值、色澤等。目前利用基因工程技術將調控棉花纖維發育相關的基因導入棉花以提高棉花纖維品質方面的研究也已經取得了初步進展。主要表現以下幾個方面：①與纖維伸長相關的基因：如伸長蛋白基因(Expansin)[4]、木聚葡糖內糖基轉移酶/水解酶(XTH)[5]、E6啟動子驅動的兔角蛋白基因(keratin)[6]、蠶絲心蛋白基因(fibroin)[7]、棉纖維特異表達啟動子GAE6-3A驅動的蠶絲芯蛋白輕鏈基因(FBN)[8]；②棉纖維細胞植物激素合成及信號途徑相關基因：被報道對棉纖維發育具有明顯影響并獲得轉基因棉花植株的有油菜素內酯(BR)相關基因GhBRII[9,10]、編碼類固醇5α還原酶活力基因GhDET2[11]、赤霉素(GA)相關基因棉花赤霉素G20氧化酶1基因GhG20ox1[12]、棉花阿拉伯半乳糖蛋白基因GhAGP4[13]、細胞激動素(CK)相關基因GhCKX[14]；③棉花纖維中細胞骨架結構蛋白及其調節因子：棉花肌動蛋白基因GhCAT1[15,16]、棉花切割蛋白基因GhKTN1[17]、棉花肌動蛋白解聚因子GhADF1[18]、芥末膜連蛋白基因(AnnBj1)[19]、棉花膜聯蛋白基因GbAnn9[20]；④影響糖類物質代謝的基因：纖維素合酶基因acsA和acsB基因[21,22]、蔗糖磷酸化合酶SPS基因[23]、蔗糖合酶基因Sus[24,25]、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因GhUGP1[26]；⑤苯丙烷代謝相關基因：棉花苯丙烷類化合物木質素合成基因GhLIM2[27]。這些基因轉入受體棉花后，分別獲得了比受體纖維品質有所提高的轉基因后代株系，另外還有許多和棉纖維品質相關的基因仍在研究之中。

現有研究表明苯丙烷類代謝是棉花纖維中僅次于纖維素代謝的第二大代謝途徑，苯丙烷代謝和棉花纖維細胞壁發育密切相關，其代謝產物苯丙烷類化合物和棉花纖維品質密切相關[28～31]。肉桂酸脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)是苯丙烷代謝途徑上一個重要的基因家族，在形成細胞壁交聯結構、細胞壁的延伸停止、次生壁發育起始及次生壁的發育中起重要作用。ChCAD6基因是CAD基因家族中重要的功能基因，該基因的表達量與棉花纖維的次生壁發育同步[28]。本團隊從發育的棉花纖維中克隆出調節細胞壁交聯結構形成的相關主效基因GhCAD6(GenBank序列號為：EU281305.1)，將GhCAD6基因利用農桿菌介導法轉化到棉花受體，獲得了轉化GhCAD6基因的陽性植株[32]。本研究在此基礎上進一步研究外源GhCAD6基因在棉花基因組中的表達及其在不同發育階段棉纖維中的表達量，為研究外源GhCAD6改良棉花纖維品質的機理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用農桿菌介導法將GhCAD6基因轉入陸地棉新陸早36號，將收獲的轉基因棉籽種植后，在每年的選育過程中每代都選擇抗卡那霉素后代植株，并結合纖維品質測試結果選擇纖維品質變化明顯的轉基因材料作為下一次種植的材料，連續種植6代后獲得轉基因株系作為本試驗中的轉基因材料(T6)。對照為未轉基因的新陸早36號(CK)。試驗材料于2016年種植于新疆瑪納斯分子育種試驗基地。

苗期再次對T6代轉基因植株進行卡那霉素的抗性篩選，分別采摘抗卡那霉素的轉基因植株和對照棉樣的葉片液氮中迅速冷凍，于-80℃保存備用。

在棉花盛花期標記抗卡那霉素植株當天開花的棉鈴，按5 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA和25 DPA共5個時期采集棉鈴，5 DPA采集20～30個、10 DPA 20～25個、15 DPA 15～20個、20 DPA采集10～15個、25 DPA采集5～10個，采摘后立即迅速用鑷子去除棉殼，用預先準備好的錫箔紙包好，每包1～2個棉鈴，做好標記，將包裹棉鈴的錫箔紙迅速投入液氮中速凍，-80℃冰柜中保存備用；對照棉樣相同發育時期的棉鈴也采用和轉基因植株相同的處理。

1.2 試驗方法

1.2.1目的基因及功能片段的PCR檢測 按植物基因組DNA提取試劑盒(購自天根公司)使用說明提取棉花幼嫩葉片中的DNA。根據基因序列用Primer 5.0軟件分別設計引物，然后送由北京六合華大基因科技有限公司合成。其中抗性標記基因NPTⅡ-F：5′-GCACAACAGACAATCGGC-TGCTC-3′，NPTⅡ-R：5′-GCCATGGGTCACGAC-GAGATCC-3′，擴增片段大小為496 bp；目的基因GhCAD6-F：5′-TGTGCAGGGGTGACAGTTTAC-3′，GhCAD6-R：5′-CCCAATAAAACTCCCTGTAATCG-3′，擴增片段大小為501 bp。

分別對抗卡那霉素植株進行卡那霉素基因NPTⅡ和GhCAD6基因的PCR檢測。并以對照葉片基因組DNA為陰性對照，以E6-pCAMBIA-2300-GhCAD6質粒為陽性對照，無菌水為空白對照，提取的轉基因棉花基因組DNA為模板，反應體系(20 μL)：DNA(100 ng/μL) 1 μL，2×PCR Mix 10 μL，引物(10 μmol/L) 0.75 μL，ddH2O補足。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94℃變性45 s，52℃退火30 s，72℃延伸45 s， 35個循環；72℃延伸 10 min，4℃保存。PCR產物置1.5%瓊脂糖中電泳，并用紫外凝膠成像儀觀察檢測結果。

1.2.2PCR陽性植株基因組的Southern雜交檢測 以PCR檢測為陽性的植株葉片基因組DNA為模板，CK葉片基因組DNA為陰性對照，質粒E6-pCAMBIA-2300-GhCAD6 DNA為陽性對照。用限制性內切酶BamHⅠ和XbaⅠ酶切基因組及質粒DNA，酶切體系：18 μL DNA(1 μg/μL)，限制性內切酶XbaⅠ 2 μL， 10×buffer 5 μL，無菌水補足至50 μL，37℃酶切18 h。上述1.2.1中得到的目的基因GhCAD6的PCR產物采用天根通用型DNA純化回收試劑盒純化，按照地高辛標記的雜交試劑盒Ⅰ(Roche公司)說明書標記探針。按照地高辛試劑盒說明書和分子克隆實驗指南(第二版)[33]配制藥品，進行Southern雜交檢測。

1.2.3不同發育階段棉纖維中GhCAD6的熒光定量PCR檢測 ①棉花纖維RNA的提取及反轉錄。熱硼酸-蛋白酶K法[34]提取經Southern雜交檢測出現雜交信號的轉基因植株發育5 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA、25 DPA的棉纖維中的RNA，采用北京全式金生物技術有限公司的反轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA。

對預測模型正負樣本比例、特征量、算法核心參數進行調優，針對性提高預測結果的正確率及預測精度。整體調優參數如下：

②實時熒光定量PCR檢測。選擇GhUBQ7作為內參基因，在NCBI數據庫中查找內參基因和目標基因的序列信息，使用NCBI引物設計工具，Primer-Blast進行設計，并使用相關程序對引物序列進行特異性檢驗，由上海生物工程公司合成引物。引物序列如下：GhCAD6-F：5′-GTTCCTGGGCATGAAGTGGT-3′，GhCAD6-R：5′-TGCAACATCCAACAAGACAACC-3′；GhUBQ7-F：5′-AGA-GGTCGAGTCTTCGGACA-3′，GhUBQ7-R：5′-GCTTGATCTTCTTGGGCTTG-3′。

以稀釋后的棉花纖維cDNA為模板，以GhCAD6-F和GhCAD6-R為引物，選用棉花纖維的GhUBQ7為內參基因，GhUBQ7-F和GhUBQ7-R為內參基因引物，進行熒光定量PCR，反應體系(20 μL)為：SYBR? Select Master Mix (2X) 10 μL，Forward Primer (10 μmol/L) 0.40 μL，Reverse Primer(10 μmol/L) 0.40 μL，cDNA 1 μL，RNase-free 水補足到20 μL。反應條件為：UDG Activation AmpliTaqDNA，50℃ 2 min；Polymerase, UP Activation，95℃ 2 min；95℃，15 s，60℃，1 min，40個循環。得到各自的Ct值(循環閾值)。所有反應包括3次生物學重復。

③成熟棉花纖維品質檢測。分別收獲轉基因單株和受體(CK)自然成熟棉花纖維，用小型軋花機脫籽，纖維送農業部品質監督檢驗測試中心采用大容量纖維測試儀(HVI)檢測棉花纖維品質。

2 結果與分析

2.1 轉基因后代PCR檢測

利用能夠起到篩選作用的新霉素磷酸轉移酶基因(NPTⅡ)作為檢測基因， PCR產物大小為496 bp，結果如圖1所示，結果初步說明檢測基因已經轉入棉花基因組中。

經上步檢測之后，在已經篩選出的部分陽性克隆中，利用能夠擴增GhCAD6基因的特異性引物進行轉基因后代的PCR檢測，PCR產物大小501 bp，結果如圖2所示，結果初步說明目的基因已經轉入棉花基因組中。

圖1 轉基因后代NPTⅡ引物PCR檢測結果Fig.1 PCR amplification with NPTⅡ primers for generation of transgenic cotton.注：M. DL2000 Marker; 1.陽性對照; 2.非轉基因對照; 3.陰性對照; 4～17.轉基因后代(T6)棉花樣品。

圖2 轉基因后代GhCAD6引物PCR檢測結果Fig.2 PCR amplification with GhCAD6 primers for generation of transgenic cotton.注：M. DL2000 Marker; 1～14.轉基因后代(T6)棉花樣品; 15.非轉基因對照; 16.陰性對照; 17.陽性對照

根據卡那霉素篩選和PCR檢測結果可以發現轉GhCAD6基因的植株經過6代篩選后，已基本保持穩定，只有極少數非轉基因植株。

2.2 轉基因后代植株葉片Southern雜交檢測

使用目的基因GhCAD6重組質粒為模板進行PCR擴增，得到的PCR產物進行純化回收后作為探針。圖3為目的基因的Southern雜交結果，其中未轉化植株CK-沒有出現雜交信號，而轉基因植株1～4均出現了明顯的雜交信號，表明GhCAD6基因以單拷貝的形式整合到受體棉花基因組中。

2.3 轉基因后代植株纖維熒光定量PCR檢測

圖3 轉GhCAD6基因棉花后代部分材料的Southern雜交結果Fig.3 The Southern blotting results of some GhCAD6 transgenic cotton offspring.注：CK-:陰性對照;1～4.轉基因植株;CK+:陽性對照。

的總RNA，利用紫外分光光度儀測定其吸光度，其OD260/OD280在1.81～2.06，說明總RNA的純度較高。總RNA的電泳檢測結果如圖4所示，28 S與18 S條帶清晰，且28 S條帶亮度約為18 S條帶亮度的2.0倍，說明樣品的RNA保存完好，可用于后續試驗。下方還能觀察到一個更小稍微擴散的條帶，主要是由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA等)組成。

圖4 纖維總RNA電泳圖Fig.4 Electropherogram of total RNA in cotton fiber.

2.3.2擴增曲線與熔解曲線分析 經分析得知，目的基因GhCAD6的Ct值范圍為27～32，內參基因GhUBQT的Ct值范圍為23～27。基因GhCAD6和內標基因GhUBQT的熔點峰分別出現在79℃和83.5℃，曲線平穩，試驗的結果是單一的峰型，峰尖且窄，而且每個峰的位置基本一致，說明試驗條件合適，引物設計合理，在PCR擴增過程中沒有非特異性擴增出現，是非常理想的熔解曲線，可進行后續的數據分析。

2.3.3GhCAD6基因在不同纖維發育階段的表達量 棉纖維不同發育階段中GhCAD6基因的表達量結果見圖5，從圖5中可以看到在非轉基因棉花纖維中GhCAD6基因的整體表達趨勢是先升高再降低，隨著棉花纖維的發育在開花后20天(20 DPA)時GhCAD6基因的表達量達到最高，但在25 DPA時表達量又迅速下降。而在轉基因棉花植株，GhCAD6的表達量在纖維發育15 DPA時出現降低趨勢，其他時期的表達趨勢與其對照相似，其中10 DPA和20 DPA時表達量與15 DPA間存在顯著差異，15～20 DPA與10 DPA間存在顯著差異，25 DPA與20 DPA間存在顯著差異。而5～20 DPA是棉花纖維伸長的關鍵時期，由此說明GhCAD6基因在纖維伸長期起著十分重要的作用。從圖5中可以看出轉GhCAD6基因的后代材料中GhCAD6基因的表達量明顯低于其對照材料，其中15～25 DPA時轉基因材料和其對照間GhCAD6基因的表達量存在極顯著差異。

2.4 GhCAD6基因對棉纖維品質的影響

表1是部分轉GhCAD6基因單株纖維品質檢測結果，從表中可以看出將GhCAD6基因導入棉花后，后代植株纖維上半部平均長度、比強度和整齊度都比對照有所增加，其中對照纖維長度為27.72 mm，轉基因植株纖維平均長度在29.38～31.28 mm之間，平均值為30.40 mm，和對照相比增幅在6%～13.9%之間；對照斷裂比強度為26.1 cN/tex，轉基因斷裂比強度在28.0～33.2 cN/tex之間，平均值為30.17 cN/tex，和對照相比增幅在7.3%～27.2%之間，整齊度增高，馬克隆值增大，伸長率下降。

圖5 纖維不同發育階段GhCAD6基因的相對表達量Fig.5 Relative expression of GhCAD6 gene at different developmental stages of cotton fiber.注：不同小寫字母與大寫字母表示在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

編號上半部平均長度(mm)斷裂比強度(cN/tex)整齊度指數(%)馬克隆值伸長率(%)早3627.7226.184.404.626.70轉基因株系131.2831.085.604.686.00轉基因株系230.9930.484.903.936.20轉基因株系331.5631.486.404.175.90轉基因株系430.7830.884.904.476.00轉基因株系530.8630.485.604.736.30轉基因株系630.8330.286.304.456.20轉基因株系730.0628.285.404.916.30轉基因株系829.9628.886.704.796.00轉基因株系930.0329.386.004.866.00轉基因株系1030.1529.186.304.766.10轉基因株系1130.6128.086.705.046.20轉基因株系1229.9328.786.604.936.30轉基因株系1329.8929.885.305.096.90轉基因株系1429.5529.085.204.846.80轉基因株系1529.6029.185.004.966.90轉基因株系1630.3832.586.204.787.00轉基因株系1730.9333.286.604.667.00轉基因株系1830.7532.985.705.017.00轉基因株系1929.3830.485.805.016.90轉基因株系平均值30.4030.285.854.746.42

3 討論

本實驗使用的是農桿菌介導轉化法得到的棉花新陸早36號轉GhCAD6基因的T6代材料。在每次的選育過程中每代都選擇棉花纖維長度增加較多，變化明顯的轉基因抗卡那霉素后代植株作為下一次種植的材料，該方法大大縮短了得到高純度的轉基因后代材料所需要的時間。在本實驗中也發現在轉基因株系種植到T6代時已基本穩定，僅有較少的分離。經PCR檢測發現目的基因和標記基因已存在于轉基因植株葉片基因組中，Southern雜交檢測出雜交信號，目的基因以單拷貝的形式插入到受體基因組中并得以表達，說明該目的基因能夠在轉基因后代中穩定遺傳。

基因表達的定量檢測方法很多，主要從蛋白表達水平、mRNA表達水平及外源DNA幾個方面入手，包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)[36,37]、蛋白雜交[38,39]、高效液相色譜(HPLC)[40,41]、Southern雜交[42]、Northern雜交[43]、生物芯片技術(Biochips)[44]及聚合酶鏈式反應(PCR)技術、半定量RT-PCR[45]、實時熒光定量PCR(Real-time PCR)[46]等。各個檢測方法在檢測基因表達量時都有其優缺點，其中實時熒光定量PCR技術具有特異性高、靈敏度高、可定量、有效解決PCR污染問題及自動化程度高等優點，保證了結果的可靠性和可重復性，已廣泛應用于分子生物學和醫學等研究領域。但對于棉花纖維富含酚類化合物、多糖、次生代謝產物和內源RNA酶活性高等特點，適宜的棉花纖維RNA提取方法、合適的引物及內參基因是保證實時熒光定量PCR實施的關鍵，合適的實時熒光定量PCR反應條件也是實驗實施必不可少的步驟之一。在本研究中，針對棉花纖維的特點，選用熱硼酸-蛋白酶K法提取出棉花纖維中的RNA，避免了酚類、糖類等化合物對RNA的污染及RNA的完整性，再結合本研究中的實時熒光定量PCR的反應條件，從而保證了該技術在檢測GhCAD6基因的表達量的順利實施。該技術具有以下優點：①自動收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，提高了實驗的靈敏度，保證了結果的可靠性和可重復性；②免除了常規PCR中的電泳、定量掃描等后續繁瑣步驟，大大縮短了實驗時間；③操作簡單，具有很強的推廣性。CAD位于苯丙烷代謝途徑最后一步反應[47]，Fan等[28]從發育的棉花纖維中克隆了2個肉桂酸脫氫酶基因GhCAD1和GhCAD6的cDNA序列，發現這兩個基因在棉花次生壁增厚期優勢表達，表明CAD可能在棉花纖維次生壁形成過程中有重要的功能。Li等[48]研究表明GhCAD6基因被定位在第26號染色體上，參與棉纖維中的苯丙烷類單元和細胞壁酚酸的代謝。本研究也表明GhCAD6基因導入棉花受體后，其纖維長度、比強度得到明顯提高，進一步證明了該基因在改良棉花纖維中的作用。本研究發現，轉基因后代植株中GhCAD6基因的表達量在15 DPA時降低，20 DPA時又表現升高趨勢，而轉基因植株纖維品質明顯高于其對照，該結果與袁輝[49]采用半定量RT-PCR法對棉花纖維發育過程中基因GhCADx進行量化分析的結果一致。這也可能是轉GhCAD6基因造成棉花纖維品質改變的原因。但苯丙烷代謝是個非常復雜的代謝途徑，涉及很多基因，轉基因GhCAD6棉花的植株纖維中GhCAD6的表達量總體上低于對照的原因還需進一步研究。