計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)治療急性關(guān)節(jié)炎的秋水仙堿生物電子等排抑制劑研究

孫 婧, 劉 丹, 慧文其

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,陜西咸陽 712046;2.西安市第五醫(yī)院, 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 西安 710082

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種免疫系統(tǒng)疾病,其特征是血清尿酸濃度增加[1]。隨著現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展與計(jì)算分子性質(zhì)方法的開發(fā),讓利用計(jì)算機(jī)技術(shù)來幫助藥物發(fā)現(xiàn)，即計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)成為可能[2,3]。 如果目標(biāo)酶的三維結(jié)構(gòu)受體可以通過X射線晶體學(xué)獲得,并優(yōu)先與共結(jié)晶的配體結(jié)合,結(jié)合位點(diǎn)和配體的模式用交互式計(jì)算機(jī)圖形技術(shù)和計(jì)算化學(xué)直接研究生物大分子——配體復(fù)合物是可行的[4]。因此,研究在配體和酶/受體之間的相互作用也是可行的。將新的候選配體“對(duì)接”到結(jié)合位點(diǎn)中,以研究該結(jié)構(gòu)是否能夠以最佳方式與受體相互作用, 這個(gè)過程被稱為基于結(jié)構(gòu)的配體設(shè)計(jì)[5～7]。

秋水仙堿(Colchicine,COL)是一種用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物,它能夠阻止白細(xì)胞進(jìn)入受影響的區(qū)域,因此有助于緩解疼痛和壓痛,適用于急性關(guān)節(jié)炎。 但是，秋水仙堿會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用,包括腹瀉、惡心、抽筋、腹痛和嘔吐等[8～10]。實(shí)驗(yàn)研究近一步證明秋水仙堿還會(huì)導(dǎo)致基因突變和復(fù)制障礙。因此, 尋找COL對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有效且副作用小的新型衍生分子是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎新藥開發(fā)的重要途徑之一。本研究運(yùn)用對(duì)接模擬技術(shù)設(shè)計(jì)出秋水仙堿衍生的生物電子等排抑制劑，以期為新藥的開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 分子對(duì)接模擬

所有的計(jì)算都使用Autodock(4.2版本)作為對(duì)接工具(8-12);利用PyMOL (pymol.org)、 Chimera (cgl. ucsf. edu/chimera)、 Discovery Studio Visualizer v3.5(Dassault Systèmes BIOVI, San Diego, CA, USA)和Molecular Modelling ProPlus(7.0版; Norgwyn Montgomery Software, Inc., North Wales, PA, USA)實(shí)現(xiàn)對(duì)接研究中的可視化。

1.2 秋水仙堿受體與秋水仙堿對(duì)接

1.2.1晶體結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu),由與綁定配體相關(guān)的受體組成,從結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。 所有的關(guān)于受體結(jié)構(gòu)的主要信息(識(shí)別號(hào). 3E22.pdb)均注冊(cè)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中。

1.2.2蛋白質(zhì)加工 下載的受體蛋白顯示了5個(gè)鏈,稱為鏈A～E。 5條多肽鏈并無共價(jià)相互作用，由于此蛋白質(zhì)的每個(gè)單位都不具有酶學(xué)性質(zhì)，所以為了方便計(jì)算，在不影響結(jié)果的前提下，選擇刪除其中的4個(gè)單位，只留下其中的一個(gè)作為靶標(biāo)進(jìn)行處理。從這5個(gè)鏈中選擇鏈B進(jìn)行實(shí)驗(yàn),剩下的鏈被刪除。 鏈B的微管蛋白質(zhì)包含COL受體配體,使用Chimera軟件分離。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，該蛋白由A～E鏈形成類似常青藤的三維結(jié)構(gòu)，而秋水仙堿與微管蛋白β-2B鏈相互作用，引發(fā)下游信號(hào)。其中，β-2B鏈由蛋白結(jié)構(gòu)中的 B鏈和D鏈組成，已報(bào)道的蛋白晶體結(jié)構(gòu)顯示秋水仙堿與B鏈結(jié)合。因此，為減少計(jì)算量，僅模擬B鏈與配體分子相互作用。

1.2.3配體結(jié)構(gòu) 配體與受體3E22.pdb分離,使用Chimera軟件(14)。 配體通過自動(dòng)對(duì)接程序進(jìn)入受體。

1.2.4網(wǎng)格框 AutoDock中的活性區(qū)域是通過在活性點(diǎn)附近創(chuàng)建一個(gè)網(wǎng)格框來定義的。網(wǎng)格盒在對(duì)接過程中起著重要的作用,因?yàn)樗鼈儽辉O(shè)計(jì)用來覆蓋所有在活性區(qū)域內(nèi)存在的氨基酸,這些氨基酸除了在受體中存在外,還是必需的。 網(wǎng)格框工具使用3個(gè)拇指輪小部件,這意味著在x、y和z點(diǎn)尺寸可能會(huì)改變。網(wǎng)格點(diǎn)之間的間距可以用一個(gè)額外的指輪來調(diào)整。 在本文的研究中,網(wǎng)格點(diǎn)之間的間距固定為0.408 ?,被考慮的點(diǎn)數(shù)分別為x、y和z維度上40、48和50點(diǎn),x、y和z中心分別為258.798、7.947和28.673。

通過采用以下方法對(duì)分子對(duì)接的抑制常數(shù)Ki進(jìn)行計(jì)算,得到分子對(duì)接模擬技術(shù)的結(jié)果：

Log Ki =ΔG/RT×1/2.303

Ki = e,

ΔG/RT,

Ki = antilog ΔG/1362.97988

其中，G=結(jié)合能; R=1.986 kmol; T=298K。

1.2.5齒向修形 已知的微管蛋白抑制劑COL被替換為不同位點(diǎn)的生物等甾醇, 以提高藥效和藥物的相似性, 并減少毒性和相關(guān)副作用。

1.2.6毒性、吸收、分布、代謝和排泄毒性(ADME-T)研究 修飾后的分子(organic-chemistry.org/prog/peo)使用在線程序OSIRIS分析,預(yù)測(cè)任何有毒基團(tuán)或具有ADME-T活性的分子。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)接

所有的分子都被檢出,所有的對(duì)接研究都通過檢查化學(xué)相似性、校準(zhǔn)和結(jié)合能(表1)進(jìn)行了驗(yàn)證。COL受體配體在受體內(nèi)被識(shí)別。圖1顯示了覆蓋微管蛋白受體所有結(jié)合殘基的網(wǎng)格框，并給出了所下載的蛋白質(zhì)與COL受體配體的所有鏈。

2.2 驗(yàn)證對(duì)接過程

為了驗(yàn)證對(duì)接某一特定配體與某一特定大分子的對(duì)接過程,本研究考慮了三個(gè)參數(shù)：①結(jié)合能。鏈接對(duì)接配體的結(jié)合能在5～15 kcal/mol之間。②疊加。配體的對(duì)接構(gòu)象與被下載的蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)疊加。成功地完成了與COL(已經(jīng)存在于受體內(nèi))的Autodock對(duì)接算法的測(cè)試,并與COL的參考結(jié)構(gòu)(即其晶體結(jié)構(gòu))進(jìn)行了對(duì)接。圖2D為COL生物活性構(gòu)象疊加的對(duì)接構(gòu)象。為了改進(jìn)結(jié)果,成功地實(shí)現(xiàn)了COL的重新對(duì)接。③交互。與蛋白質(zhì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)中存在的相互作用相比,對(duì)接時(shí)必須觀察到對(duì)接的配體與受體之間一致的相互作用。在本研究中觀察到的COL結(jié)合配體與在微管蛋白受體中存在的結(jié)合殘基之間的互作如圖2E所示。在受體3E22中,ALA15(丙氨酸-15)和ASN228(天門冬酰胺-228)中,所有配體的鍵都保持彈性。 ALA15和ASN228的所有鍵都是可旋轉(zhuǎn)的。

圖1 蛋白質(zhì)與COL受體配體的所有鏈Fig.1 All the chains of protein and COL receptor ligands.

化合物結(jié)構(gòu)親和力(μmol/L)鍵能 (kcal/mol)Colchicine5.957.13COL_110.946.77COL_29.186.87COL_313.186.66COL_469.295.67COL_520.196.4

圖2 秋水仙堿及其衍生物與3E22蛋白B鏈相互作用關(guān)系圖Fig.2 Diagram of interaction of Colchicine and its modified derivative with 3E22 protein B chain.A.秋水仙堿與3E22蛋白B鏈相互作用；B.設(shè)計(jì)化合物COL_1與3E22蛋白B鏈相互作用；C.設(shè)計(jì)化合物COL_2與3E22蛋白B鏈相互作用；D.設(shè)計(jì)化合物COL_3與3E22蛋白B鏈相互作用；E.設(shè)計(jì)化合物COL_4與3E22蛋白B鏈相互作用；F.設(shè)計(jì)化合物COL_5與3E22蛋白B鏈相互作用。

2.3 毒性和ADME-T研究

本研究中的毒性和ADME-T分析結(jié)果顯示在表2中。結(jié)果表明,所有4個(gè)基于秋水仙堿的微管蛋白抑制劑沒有任何主要的毒性效應(yīng),包括致突變性、致瘤性、刺激性以及生殖效應(yīng),因?yàn)樵诰€程序OSIRIS (Molecular Property Explorer)沒有確定在設(shè)計(jì)的分子內(nèi)存在負(fù)責(zé)這些毒性作用的任何有毒官能團(tuán)。所有的分子都具有良好的藥代動(dòng)力學(xué),并嚴(yán)格按照Lipinski的五(18)法則對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行篩選。

2.4 COL系列化合物對(duì)接模式研究

設(shè)計(jì)的系列化合物COL_1-5分別與微管蛋白對(duì)接，研究其結(jié)合模式?；衔顲OL_1苯環(huán)結(jié)構(gòu)上的甲氧基與Lys352之間形成氫鍵，結(jié)合方式不同于秋水仙堿，預(yù)測(cè)活性較差。COL_2酰胺結(jié)構(gòu)上的羰基與Thr353之間形成氫鍵，苯環(huán)結(jié)構(gòu)橫亙于β片層和α螺旋之間，存在空間沖突，預(yù)測(cè)活性不高。COL_3分別與Asn349和Asn258形成氫鍵，作用較為牢固，疏水的苯環(huán)插入β片層和α螺旋之間，預(yù)測(cè)活性較佳。COL_4作用方式不同于秋水仙堿，酰胺取代的苯環(huán)插入蛋白內(nèi)部，而三取代的苯環(huán)暴露于蛋白外部，同Asn258和Lys352形成氫鍵，預(yù)測(cè)活性最佳，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。COL_5作用方式類似于COL_4，酰胺結(jié)構(gòu)位于蛋白內(nèi)部，三取代的苯環(huán)位于蛋白外部，同Asn349形成氫鍵，預(yù)測(cè)活性也較好。

表2 秋水仙堿及其衍生物的吸收、分布、代謝和排泄毒性分析及毒性預(yù)測(cè)Table 2 Absorption, distribution, metabolism and excretion toxicity profiling and toxicity prediction of Colchicine and the modified Colchicine derivative.

3 討論

結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的秋水仙堿與微管蛋白結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，可以看到微管蛋白上的Asn258與秋水仙堿環(huán)上的羰基之間有氫鍵相互作用，疏水的苯并七元環(huán)插入由β片層和α螺旋形成的空腔中。文中設(shè)計(jì)的系列化合物COL_1～5分別與微管蛋白對(duì)接，其中COL-3與COL-4均與Asn258有相互作用，與已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)較為符合，同時(shí)考慮到COL-4對(duì)接分?jǐn)?shù)最高，與蛋白結(jié)合穩(wěn)定，預(yù)測(cè)活性較好，有可能成為新型的微管蛋白電子等排抑制劑，但仍需進(jìn)一步的生物活性測(cè)試。

本研究結(jié)果表明，新型秋水仙堿類人腎小管蛋白抑制劑可能是治療關(guān)節(jié)炎的有效藥物。從抑制常數(shù)Ki值可以看出，所設(shè)計(jì)的抑制劑均與大分子表現(xiàn)出良好的結(jié)合力。所有設(shè)計(jì)的抑制劑的毒性和ADME-T分析證實(shí)了沒有任何毒性官能團(tuán)。所有的抑制劑都是按照Lippinski’s Rule of Five(18)設(shè)計(jì)的，因此，所有的抑制劑都表現(xiàn)出與藥物相似的作用。與COL相比，所有設(shè)計(jì)的COL衍生物表現(xiàn)出更強(qiáng)的結(jié)合力，此外，與母體分子COL相比，其物理化學(xué)性質(zhì)也有所改善。