創傷性腦損傷模型研究進展

趙清輝, 琚芳迪, 蘇澤華, 羅秋麗, 儀 楊, 張曉康, 張 鑫, 謝 飛, 馬雪梅

北京工業大學生命科學與生物工程學院, 北京 100124

創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是世界范圍內的嚴重問題。每年，全世界大約有1 000萬人遭受創傷性腦損傷，并且相當多的患者會因此暫時或永久殘疾、甚至死亡。有研究預測，到2020年，TBI將成為全球負擔最重的第三大疾病[1～5]。此外，TBI被證實與癲癇、阿爾茲海默病、帕金森病、慢性神經炎等疾病密切相關[6～9]。為了尋找合理的TBI治療方案，研究人員建立了許多體內動物模型和體外細胞模型，用于研究TBI的病理生理機制。鑒于臨床上TBI發生情況各異，研究人員建立了不同類別的動物模型來復制不同類型的創傷性腦損傷，雖然較大的動物在尺寸上和生理上與人類更為接近，但由于嚙齒類動物具有體積小、成本低、容易量化等特點，目前被廣泛應用于TBI動物模型的建立[10,11]。早期的TBI動物模型主要模擬了腦損傷的生物力學變化，近年來創建的動物模型還可用于研究由頭部創傷引發的分子相互作用機制以及分子級聯反應[11,12]。同樣的，體外TBI模型也是研究TBI病理生理機制的重要工具，其優勢在于能夠減少體內復雜因素的干擾，從而更準確地反映由機械損傷引起的細胞、組織的生物學變化。此外，與體內模型相比，體外模型具有重復性好、可控性好、實驗成本較低、倫理問題較少等優勢。根據致傷方式的不同，常用的TBI模型可分為機械作用力損傷模型、壓力損傷模型、爆炸傷模型、反復性輕度損傷模型。本文對上述常用模型進行了綜述和比較分析，以期為尋找在臨床上具有神經保護效果的治療方案提供幫助。

1 機械作用力損傷模型

1.1 機械作用力損傷TBI動物模型

機械作用力損傷TBI動物模型常用的有自由落體打擊(weight-drop，WD)模型和控制性皮層沖擊損傷(controlled cortical impact，CCI)模型。

WD是一種常用的造模方法，通過重物自由下落打擊硬腦膜或者顱骨造成腦損傷，通常采用一根導管來引導重物自由下落，通過重物的重量和下落的高度來控制損傷程度[10,11,13]。Feeney WD模型是通過直接打擊硬腦膜造成腦皮質挫傷，并通過調節撞擊頭的重量和自由下落的高度來建立輕度、中度、重度腦損傷模型，主要用于模擬腦震蕩和腦挫裂傷[14～18]。Marmarou WD模型在Feeney模型的基礎上做了2個方面的改進：①將麻醉大鼠固定在海綿平臺上，既可確保外力的瞬時性，也可在打擊后通過抽出海綿平臺，避免二次打擊；②在頂部正中放置1個直徑1 cm、厚0.3 cm的金屬片以確保外力作用的彌散性，主要用于模擬彌漫性腦損傷。此模型的優點是方法簡單、條件易于控制等；缺點是致死率較高。

CCI模型是通過高速運動的空氣所產生的沖擊力帶動金屬撞擊頭直接打擊暴露的硬腦膜，造成一定程度的腦損傷。其主要用于復制TBI后皮質組織缺失、急性硬膜下血腫、軸索損傷、腦震蕩、血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)功能障礙甚至昏迷等癥狀。該模型可以通過調節撞擊停留時間、撞擊速度、打擊深度來控制損傷程度[19～21]。與Marmarou WD模型相比，CCI模型改善了機械因素，極大降低了模型致死率；還可通過腦立體定位儀對顱腦打擊位置精準定位，打擊力度更為精確；同時，撞擊后，撞擊頭自動迅速回收，避免了因擠壓造成的損傷或因重物反彈造成的二次損傷[11,22,23]。總之，CCI模型致傷準確、重復性好、穩定性高，使TBI生物力學的研究更為有效。

1.2 機械作用力損傷TBI細胞模型

機械作用力損傷TBI細胞模型主要包括機械橫斷體外細胞模型(cell transection injury)和牽張損傷體外細胞模型(cell stretch injury)。

機械橫斷體外細胞模型是采用塑料細針、刀片或激光將附著在培養皿上的神經細胞突起與胞體離斷，用于模擬穿刺傷、穿透性顱骨骨折以及TBI后各種腦組織病變。Faden等[24]采用1個由28個不銹鋼葉片連接的沖擊裝置，對培養的大鼠皮層神經元細胞誘導機械損傷，切割裝置在96孔組織培養板的細胞層中做均勻切割，間距為1.2 mm；24 h后通過檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放量來測定細胞活力。結果顯示，切割裝置直接導致葉片下的細胞死亡，24 h內，傷口周圍的神經細胞逐漸死亡。隨后，研究人員對模型進行改進，直接省去沖擊裝置，采用更為簡單的黃色槍頭(直徑1.5 mm)和白色槍頭(直徑1 mm)機械性劃割培養的大鼠皮層神經元細胞，根據劃傷面積的不同來建立不同程度的損傷模型[25,26]。該模型無需特殊設備條件，操作簡便，是一種簡單有效的體外模型；而其不足是機械損傷參數無嚴格的標準，損傷嚴重程度僅以損傷細胞數目分級。

牽張損傷體外細胞模型是通過改變細胞形態造成細胞不同程度的伸展牽張，目的主要是為了研究TBI的生物力學效應。其中應用較為廣泛的模型是通過壓縮氣體使夾持的圓形板變形，圓形板上貼壁的神經細胞也隨之變形，根據施加的壓力大小不同造成輕度、中度和重度損傷[27～29]。此模型的缺點：在較高的變形速率下，圓形板易造成不均勻變形；由于細胞需粘附在基材上，細胞的粘附性形變的驗證就十分重要。

另一種得到廣泛應用的是采用微流體裝置建立模型，通過向柔性聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜下方的氣動通道施加氣體壓力，造成PDMS膜形變進而引起軸突拉伸損傷[30]。采用微流體裝置模型的優勢是可以檢測損傷對神經細胞特定部分的影響，即可對神經細胞特定的區域(如胞體、軸突)進行精確損傷；而其不足之處是需要笨重的氣動裝置，設備儀器較為復雜[31]。

2 壓力損傷模型

2.1 壓力操作TBI動物模型

壓力損傷TBI動物模型主要包括液壓沖擊傷(fluid percussion injury，FPI)模型和穿透性腦損傷(penetrating ballistic-like brain injury，PBBI)模型。

FPI模型是通過向顱腔內快速注入一定量的生理鹽水造成腦組織的變形和移位，從而導致腦損傷，損傷程度取決于壓力脈沖的強度。FPI模型可以復制人類TBI后顱內出血、腦腫脹和漸進性灰質損害等病理生理特點，主要用于復制臨床無顱骨骨折的TBI[32～37]。根據顱骨鉆孔位置的不同，FPI模型可以分為中央(矢狀縫上)FPI模型、矢狀竇旁(距中線<3.5 mm)FPI模型和側方(距中線>3.5 mm)FPI(lateral fluid percussion injury，LFPI)模型。早期的FPI模型主要是通過控制鐘擺下落的高度這一單一變量來控制損傷程度。為了提高可重復性，Kabadi等[38]開發了一種微處理器控制的氣動裝置，采用這種新型設備，沖擊壓力和停留時間均可得到精確控制以減少試驗之間的差異。LFPI模型產生的認知功能障礙、神經行為障礙等是臨床上TBI患者常見的癥狀。但是由于造成腦干損傷，呼吸暫停時間延長，FPI模型與其他模型相比具有較高的致死率。因此，大鼠LFPI模型中開顱手術部位的選擇確定對損傷程度至關重要，建模時要精確控制開顱手術的位置，以提高模型的可靠性和重復性。

另一種模擬顱內壓升高的模型是PBBI模型，其由高能量彈頭和沖擊波造成，這種沖擊波在大腦中產生了數倍于彈丸本身尺寸的臨時腔，而其損傷程度取決于彈射的路徑和能量轉移的程度。目前，已開發出多種新的PBBI嚙齒動物模型。Davis等[39]將PBBI探針經由骨窗進入大腦右半球，進針深度為1.2 cm，由計算機程序控制，向探針內充水，使探針彈性頭膨脹，產生1個橢圓形的水球，體積等于大腦體積的10%，球囊放水后，探頭縮回，從而建立PBBI模型。大鼠PBBI模型會造成白質和灰質損傷、腦水腫、癲癇、皮層擴散、神經膠質細胞增生、神經炎癥等，還會體現出由此造成的感覺障礙以及認知功能障礙的癥狀。與其他TBI模型相比，由于PBBI模型損傷的滲透性及其形成的暫時性腔，其在整個原發病灶中會引起廣泛的腦內出血[11,40]。正是PBBI模型所具有的特點，使其對研究中度或重度顱腦損傷的機制具有重要意義。

2.2 壓力損傷TBI細胞模型

壓力損傷TBI細胞模型包括加壓損傷(compression injury)神經細胞模型和負壓引流損傷(vacuum assisted injury)神經細胞模型。

加壓損傷神經細胞模型即通過向體外培養的細胞施加一定的壓力從而造成細胞損傷，主要用于復制閉合性腦損傷或FPI模型。但為了獲得細胞反應，增加的壓力需遠超過TBI期間發生的水平。在培養基產生的靜水壓力條件下，腦部變形可能非常小，因為腦組織幾乎是不可壓縮的，因此，需要更高的壓力(15個大氣壓左右)才能造成損傷。陳翰博[41]將星形膠質細胞的培養盒與加壓器連接并密封，注入氮氧混合氣體，分別給予不同大小的壓力，結果顯示加壓后細胞體積增大、水腫明顯，且隨著壓力的增加，水腫更為明顯。加壓損傷模型與TBI后臨床病理生理相似，且方法簡單、條件易于控制，可通過調整壓力值來控制損傷程度，主要用于中樞神經系統(central nervous system，CNS)中神經細胞機械性損傷的研究，也適用于TBI后各神經細胞繼發性損傷的研究[42～44]。

負壓引流損傷神經細胞模型是通過使用微流控裝置和實驗室真空來損傷軸突。一旦軸突生長至相鄰隔室，采用巴斯德吸管在第二隔室入口真空抽吸，在第二隔室產生一個氣泡，此氣泡會對第二隔室的軸突產生剪切力，造成軸突損傷。因此，該裝置會導致軸突損傷且不影響胞體，這種損傷方法隨后被用于篩選潛在的軸突再生的治療。基于微流體和真空的損傷機制也可用于模擬和表征急性軸索變性(acute axonal degeneration，AAD)[31]。Zhou等[45]使用微流體真空吸入損傷模型來研究損傷后觀察到的成熟軸突再生減少的途徑。在成熟軸突中，線粒體錨定蛋白(mitochondria-anchoring protein syntaphilin)SNPH阻礙線粒體運輸，從而在損傷部位產生能量缺陷。通過敲除SNPH基因增強線粒體運輸，通過增加線粒體轉運和維持受損軸突的ATP供應促進了損傷后的軸突再生。因此，真空吸入損傷模型可以表征線粒體運輸以及受損軸突的能量供應，并且能夠為軸突再生提供新的治療策略[31]。此模型的不足之處在于需要互相連接的隔室之間的高流體阻力以限制對特定神經元區域的傷害。該阻力通常由微流體裝置中的微槽提供，因此，必須仔細調整真空的持續時間和強度以減少對非特定區域的損害。

3 爆炸傷模型

顱腦爆炸傷主要指的是由爆炸沖擊波和投射物造成的顱腦損傷(blast-induced traumatic brain injury，bTBI)，是現代戰爭中的主要傷型。國內外學者針對bTBI建立了各種各樣的模型，其中常用的有自由場爆炸模型、爆炸管模型、小型爆炸源模型、以及高級爆炸模擬器(advanced blast simulator，ABS)模型[46～49]。ABS模型無需使用炸藥，而是以壓縮氣體作為動力。其結構為一圓柱形管，中間采用一種特殊材質的薄膜將圓柱形管分割為2個室，分別為加壓區和測試區，當加壓區氣壓上升到一定程度擊破隔膜所產生的沖擊波，會對放置于測試區的動物頭部造成損傷。Rodriguez等[49]采用的激波管待測區長度為2 m、加壓區長度為2.54 m、隔膜厚度為0.4 mm，將大鼠頭部放于激波管待測區，通過將空氣加壓至1 230 kPa左右沖破隔膜產生沖擊波，造成大鼠頭部損傷，從而建立bTBI動物模型。ABS模型是目前bTBI研究領域中應用最多的模型，其優點主要是安全性高、可在室內操作，從而降低了外界的干擾；且可通過調節隔膜的材料，產生不同大小的沖擊波[36,50～52]。但需要注意的是，ABS模型也有其自身的重要缺點：①氣體驅動沖擊波的物理特性可能不同于爆炸沖擊波；②隔膜碎片可能對受試對象產生影響；③管出口附近產生的射流效應可能對受試對象產生影響[46]。

同樣的，將培養的神經細胞以及腦組織切片放在激波管待測區，則可建立bTBI體外模型。Campos-Pires等[53]將小鼠海馬腦片細胞面向激波管，分別采用不同沖擊壓力來建立創傷模型，并利用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色法檢測細胞死亡水平。結果表明，爆炸傷的損傷程度隨沖擊壓峰值和沖擊波的增加而增加，且沖擊波誘導的細胞死亡方式主要是細胞凋亡。

4 反復性輕度損傷模型

反復性輕度創傷性腦損傷(repeated mild traumatic brain injury)模型通常發生在需接觸的運動(拳擊、籃球、足球、橄欖球)及家暴等情況中[11,54]。越來越多的證據表明，反復腦震蕩會導致行為異常和病理改變。目前已建立了多種反復性輕度創傷性腦損傷模型，如CCI模型、WD模型、FPI模型、Blast-TBI模型、cell stretch injury 模型[37,55～58]。研究表明，短時間內反復輕度TBI可以造成彌漫性軸索損傷和慢性神經炎，而這些病理生理現象與阿爾茲海默病、帕金森綜合癥等神經退行性疾病密切相關。由于輕度腦損傷往往被人們忽略，但反復性輕度創傷性腦損傷可能是災難性或致命性的，因此，反復性輕度創傷性腦損傷模型對TBI后神經退行性疾病的研究具有重要意義。

綜上所述，TBI模型的建立為研究相關發病機制、開發有效治療方案奠定了基礎。現將各模型的特點做一總結，具體見表1。

5 展望

盡管利用TBI模型開展腦損傷研究已取得了一定進展，但仍存在一些難以克服的不足。常用的TBI模型動物(特別是嚙齒類動物)的大腦與人腦在生理學上存在一定程度的相似性，但在腦結構和功能方面仍存在顯著差異，如在腦幾何形狀、顱角度、回旋復雜性、灰質與白質灰分比例等方面均存在差異，這對TBI模型的建立會產生不良影響[11,33]。許多TBI模型的研究并未嚴格測量TBI前后的生理變量，包括CO2分壓、O2分壓、pH、血壓和腦溫等，而這些變量在確定機體對損傷和治療的病理生理反應中非常重要。此外，年齡、性別、物種對TBI結果也會產生影響[2,4,5,62～64]，需多加研究。而TBI體外模型的局限性主要表現在組織細胞可能在離體后產生有害的應激反應；其次，組織細胞在取材的過程中已經受到損傷，這在一定程度上可能對組織的實驗性損傷產生影響。TBI體外模型需要重點解決的問題是減少細胞外環境(如血液、活化的巨噬細胞等)對神經細胞的影響，以及降低組織細胞在取材過程中造成的損傷[60,65,66]。有時，基于體內模型與體外模型的研究會產生相互矛盾的結果，但這并不意味著體外模型檢測結果不準確，可能與環境(如炎癥反應、溫度調節、氧合和局部離子濃度)的差異有密切關系[11,47,59,61,65,67]。利用2種TBI模型進行研究各有利弊，因此，在研究一種新的治療手段或藥物時，應聯合應用不同類型的TBI體內、體外模型，以模擬在損傷期間引起的不同病理生物學反應，采用這種交叉驗證的方式，可使實驗結果更為真實、可靠，減少假陽性結果的產生。

表1 常用TBI動物模型及細胞模型的特點Table 1 Characteristics of common-used TBI animal and cell models.