沒食子酸與牛血紅蛋白相互作用的研究

施沈佳, 李劍瑛, 黎中寶, 陳俊德, 吳坤遠

1.集美大學水產學院, 福建 廈門 361021；2.國家海洋局第三海洋研究所, 國家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術中心, 福建 廈門 361005；3.福建農林大學食品科學學院, 福州 350002

隨著城市化、工業化及全球化進程的加劇，以及生態環境惡化、生活方式改變、人類預期壽命延長等因素的影響，癌癥的發病率和死亡率均呈上升態勢，嚴重威脅著人類健康和社會發展，癌癥的防治已成為一個全球性問題[1,2]。

沒食子酸(gallic acid，GA)是一種天然多酚類物質，作為沒食子單寧的主要水解單體，普遍存在于植物體中[3]。同時，沒食子酸作為傳統中藥材中的活性成分，具有抗氧化、抑菌抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種生理活性[4]，且具有產量大、價格低廉、易大規模生產的特點，在醫藥、食品等領域被廣泛應用[5]，特別是在抗腫瘤的研究中，其因可口服、對腫瘤細胞具有高選擇性等特點而備受關注[6,7]。

血紅蛋白是紅細胞中的一種重要蛋白質，其在將氧運輸至人體各器官和部位的過程中是必不可少的。血紅蛋白以四聚體形式存在，由2個α亞基和2個β亞基組成，每個α亞基由141個氨基酸殘基組成，每個β亞基由146個氨基酸殘基組成，其可通過與多種內源性、外源性的分子結合，發揮轉運、存儲的功能[8,9]。牛血紅蛋白(bovine hemoglobin，BHb)與人血紅蛋白高度同源，且易獲得，常用于血紅蛋白與小分子化合物結合的研究[10～13]。

在小分子化合物與蛋白質的研究中，光譜檢測技術因具有靈敏度高、操作簡便等特點而被廣泛應用。如在血紅蛋白與小分子化合物相互作用方面，紫外-可見光法可用于研究土霉素(oxytetracycline)對血紅蛋白基團和微環境的影響[10]；利用熒光猝滅法可研究頭孢匹胺鈉對血紅蛋白的猝滅機理(包括相互作用方式、相互作用力類型)[14]；通過同步熒光技術可研究4,4′-二異硫氰基芪-2,2′-二磺酸和2,4-二硝基酚對血紅蛋白氨基酸殘基微環境的影響[15]；紅外光譜可用于表征蛋白分子的化學鍵和官能團[16]；而利用圓二色光譜可研究香草醛對蛋白質二級結構的影響[17]。這說明光譜檢測技術能夠用于檢測蛋白質的結構、功能以及其與小分子化合物相互作用后的變化，是一種有效的研究方法。

目前，對GA的研究主要集中于對其生物活性(如抗氧化、抑菌)和細胞水平(如抗腫瘤)的研究，與血紅蛋白結合的研究相對較少，且作用機制尚不明確。本研究利用光譜法研究了GA與BHb的相互作用，以期闡明GA在體內的運輸及藥理作用，并進一步探究GA與BHb結合的特性，揭示其可能存在的毒副作用，以期為GA在醫藥領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

沒食子酸(純度99%)購于美國阿拉丁工業公司；牛血紅蛋白(分子量64 500 Da)購于美國Sigma-Aldrich公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS；pH 7.0)購于美國EMD Millipore公司；溴化鉀(光譜純)購于美國PIKE公司；其他試劑均為國產分析純；實驗用水為去離子水(deionized water；18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設備

F-2700型紫外熒光光度計(日本Hitachi公司)；UH5300型紫外分光光度計(日本島津公司)；VERTEX 70型傅里葉轉換紅外光譜儀(德國Bruker公司)；Chirascan型圓二色光譜儀(英國Applied photophsics公司)；SG2型pH計(德國Mettler Toledo公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1緩沖體系的配制及檢測樣品的制備 BHb用PBS配制成3×10-6mol/L儲備液，儲存于4℃冰箱中，用于紫外-可見光譜、熒光光譜和圓二色光譜檢測；用去離子水將PBS稀釋100倍，調節pH至7.0，稀釋后用其配制濃度為3×10-6mol/L的BHb溶液，用于傅里葉變換紅外光譜檢測。

GA用PBS配制成1×10-2mol/L儲備液，振蕩器混勻，現配現用。

1.3.2紫外-可見光譜與熒光光譜的檢測 準確移取2.5 mL BHb儲備液于1 cm石英比色皿中，分別在298 K和308 K下，溫水浴反應8 min，在激發波長為280 nm、激發狹縫和發射狹縫均為5 nm的條件下，測定樣品的紫外吸收光譜和熒光發射光譜，檢測完畢后，在原樣品中依次加入1×10-2mol/L GA儲備液2.5 μL，混勻，使得溶液中GA的濃度依次為0、1.0×10-5mol/L、2.0×10-5mol/L、3.0×10-5mol/L、4.0×10-5mol/L、5.0×10-5mol/L、6.0×10-5mol/L、7.0×10-5mol/L、8.0×10-5mol/L，測定不同濃度GA與BHb反應后的熒光發射光譜。在相同條件下，分別固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，測定298 K組樣品的同步熒光光譜。扣除PBS的背景光譜。

1.3.3FTIR檢測 取10 mL BHb溶液，加入GA儲備液，使溶液中的GA濃度為8.0×10-5mol/L，置于298 K條件下水浴反應8 min，以未加入GA儲備液的BHb溶液為對照。反應結束后，將樣品凍干。取凍干樣品各1 mg，分別加入100 mg溴化鉀粉末進行壓片，進行FTIR光譜檢測，設置參數：分辨率4 cm-1、樣品掃描時間16 s、背景掃描時間32 s、掃描范圍3 800～1 000 cm-1。扣除溴化鉀的背景光譜。

1.3.4CD檢測 分別取2.5 mL BHb溶液，加入GA儲備液，使溶液中的GA濃度分別為0、2.0×10-5mol/L 和8.0×10-5mol/L，于298 K條件下水浴反應8 min。反應結束后，各移取300 μL反應溶液于1 mm石英池中，恒溫298 K，進行CD檢測，掃描波長范圍185～260 nm，帶寬 1.0 nm，步進為1 nm，單個數據點的采樣時間(time-per-point)為1 s，數據采集模式為Spectrum，以pH 7.0的PBS為背景，其光譜強度以摩爾消光系數差Δε[L/(mol·cm)]表示。扣除PBS的背景光譜。

2 結果與分析

2.1 GA對BHb血紅素基團的影響

紫外-可見光譜技術可用于探究蛋白質的結構變化、配體與蛋白質的結合活性[10]。圖1為不同濃度GA對BHb的紫外-可見光譜圖，在406 nm處有一個強吸收峰，為卟啉-Soret帶(π-π*躍遷帶)[18]，隨著GA濃度逐漸增大，406 nm處吸收峰位保持不變，說明GA與BHb的相互作用沒有改變血紅蛋白氧合狀態，不會使氧合血紅蛋白脫氧；而吸收峰強度隨著GA濃度增大而逐漸降低，由1.293 a.u.降至1.227 a.u.，下降了0.066 a.u.，下降幅度為5.1%，說明GA的加入使BHb的微環境發生了變化，但影響較小[19]；吸收峰變化幅度較小，說明GA和BHb之間的相互作用較弱[8]。綜合Soret帶峰位和吸收值的結果，說明GA對BHb的影響不直接作用于血紅素基團，即不改變BHb的氧合狀態[20]。

圖1 不同濃度沒食子酸與牛血紅蛋白相互作用的紫外-可見光譜Fig.1 UV-vis spectra of BHb in the presence of GA with various concentrations.注：0→8：在298 K條件下，3×10-6 mol/L BHb分別與0、1.0×10-5 mol/L、2.0×10-5 mol/L、3.0×10-5 mol/L、4.0×10-5 mol/L、5.0×10-5 mol/L、6.0×10-5 mol/L、7.0×10-5 mol/L、8.0×10-5 mol/L GA相互作用。

2.2 GA對BHb構型的影響

BHb的內源性熒光主要來源于色氨酸殘基和酪氨酸殘基，其對微環境的變化較為敏感，因而可利用熒光技術研究小分子與蛋白質的結合，如結合機制、結合模式、結合常數等[14,21]。本研究利用該技術研究BHb和GA之間的相互作用。圖2為不同溫度下GA與BHb相互作用后的熒光光譜。

從圖2中可知，隨著GA濃度從0增加到8.0×10-5mol/L，BHb的最大發射波長峰位發生紅移，熒光強度逐漸減弱。當反應溫度為298 K時(圖2A)，BHb的最大發射峰位從330 nm紅移至336.5 nm，熒光強度從120.9 a.u.下降至96.16 a.u.，熒光強度下降了24.74 a.u.，損失率為20.4%；當反應溫度為308 K時(圖2B)，BHb的最大發射峰位從331 nm紅移至337 nm，熒光強度從119.9 a.u.下降到75.89 a.u.，熒光強度降低了44.01 a.u.，損失率為36.7%。330 nm處的發射峰是BHb中的色氨酸殘基和酪氨酸殘基的熒光發射峰[22]，發射峰發生位移是由于GA與BHb的相互作用從而使血紅蛋白分子的空間構象產生改變[23]。熒光光譜的結果說明，GA與BHb相互作用發生了熒光猝滅，且溫度越高，熒光猝滅的效果越明顯。

圖2 不同濃度GA對BHb的熒光猝滅光譜Fig.2 Fluorescence quenching spectra of BHb in the presence of GA with various concentrations.注：0→8：在不同溫度條件下，3×10-6 mol/L BHb分別與0、1.0×10-5 mol/L、2.0×10-5 mol/L、3.0×10-5 mol/L、4.0×10-5 mol/L、5.0×10-5 mol/L、6.0×10-5 mol/L、7.0×10-5 mol/L、8.0×10-5 mol/L GA相互作用。

2.3 熒光猝滅

熒光猝滅的類型通常可分為動態猝滅和靜態猝滅。靜態猝滅是由熒光團之間的基態復合物形成而引起的。因此，靜態猝滅系統中增加溫度會使配體-蛋白質復合物的穩定性下降，猝滅常數KSV降低。與之相反，動態猝滅是由激發態熒光物質與猝滅劑之間發生碰撞而引起熒光猝滅，溫度增加，KSV也隨之升高。動態猝滅和靜態猝滅過程均可用Stern-Volmer方程表達[8]，即：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式中,F0和F分別表示未加入和加入猝滅劑時體系的相對熒光強度；KSV為動態猝滅常數(也稱Stern-Volmer猝滅常數)；[Q]表示猝滅劑的濃度；Kq為熒光猝滅速率常數，各類猝滅劑對生物大分子的最大Kq值一般為2.0×1010L/(mol·s)；τ0為無猝滅劑時熒光物質的平均壽命，生物大分子的熒光平均壽命一般約為10-8s。

根據式(1)制得圖3和表1。圖3是在不同溫度下GA對BHb的Stern-Volmer圖，相關系數>0.99，良好的擬合線性關系表明Stern-Volmer模型適用于GA和BHb相互作用機制的研究，也意味著在二者反應過程中存在著一種主要的猝滅途徑[8]。由KSV和Kq值計算結果(表1)可知，隨著溫度升高，BHb的猝滅曲線斜率增大，說明猝滅常數隨溫度的升高而增大，因此，可初步判斷GA與BHb的熒光猝滅類型是動態猝滅。KSV數量級為103，Kq的數量級為1011，與最大擴散碰撞猝滅常數Kq=2.0×1010L/(mol·s)相比僅相差1個數量級，沒有遠大于最大猝滅常數；因此，判斷GA與BHb的結合為動態猝滅過程，即熒光猝滅由分子間的碰撞引起。

圖3 不同溫度下GA對BHb的熒光猝滅Stern-Volmer圖Fig.3 Stern-Volmer plots of fluorescence quenching of BHb in the presence of GA at different temperatures.

T(K)線性方程相關性系數(r)KSV(×103 L/mol)Kq[×1011 L/(mol·s)]298F0/F=0.990 1+0.003 5[Q]0.993 53.53.5308F0/F=0.996 7+0.007 3[Q]0.997 47.37.3

2.4 結合常數、結合位點數和作用力類型

小分子藥物與蛋白質生物大分子發生作用時，體系中的小分子化合物與生物大分子之間處于一種平衡狀態，當猝滅類型為動態猝滅時，可用下列方程描述[24]：

lg(F0/F-1)=lgKa+nlg[Q]

(2)

式中,Ka和n分別表示結合常數和結合位點數，F0為BHb的熒光發射強度，F為不同濃度GA與BHb相互作用的熒光發射強度。

通過以lg(F0/F-1)對lg[Q]作圖，由直線截距和斜率分別求得298 K、308 K時的結合常數Ka和結合位點數n，結果如表2所示。在298 K、308 K條件下，n值分別為1.09和1.04，均約等于1，這意味著BHb中僅存在1個GA的結合位點；GA和BHb之間的結合常數分別為7.941×103L/mol和10.478×103L/mol，Ka值隨著溫度的升高而增加；與其他猝滅類型為靜態猝滅的小分子和血紅蛋白相互作用的結合常數相比[8,18,26]，GA與BHb的結合常數相對較小，進一步證明GA與BHb間的猝滅是一個動態過程。

通常，小分子化合物與生物大分子之間的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電作用力和疏水作用力等，可通過熱力學參數焓變ΔΗ和熵變ΔS來確定。當反應體系溫度變化不大時，焓變可看作是一個常數[27]。根據范特霍夫(Vant Hoff)公式及其推導公式，可以求得結合反應的標準吉布斯自由能變ΔG、焓變ΔH、熵變ΔS：

ΔG=-RTlnK

(3)

ΔS=(ΔH-ΔG)/T

(4)

(5)

式中,K為小分子與蛋白質相互作用的結合常數，R為氣體分子常數(取R=8.314 5 J/mol·K)，T為小分子與蛋白質相互作用時的開氏溫度，計算結果見表2。

表2 沒食子酸與BHb結合常數、結合位點數及熱力學參數Table 2 Binding constants, binding-site numbers and thermodynamics constants of the system of GA-BHb.

在298 K、308 K條件下，吉布斯自由能ΔG分別為-22.25 kJ/mol和-23.71 kJ/mol，均小于0，說明GA與BHb的反應可自發進行。在藥物與生物大分子的反應中，其主要作用類型可根據反應前后熱力學參數焓變ΔΗ和熵變ΔS的大小來判斷：當ΔH、ΔS均大于0時為疏水作用力；當ΔH、ΔS均小于0時為氫鍵和范德華力；當ΔH<0、ΔS>0時為靜電相互作用。由表2可知，ΔH=21.15 kJ/mol，ΔS=145.64 J/(mol·K)，即ΔH、ΔS均大于0，說明GA與BHb之間的作用力主要為疏水作用力。另外，ΔH>0表明BHb和GA之間的相互作用過程是吸熱的，溫度的升高會促進BHb與GA的相互作用。從熒光猝滅的角度看，隨著溫度的升高，BHb熒光猝滅程度增強，Kq值增加[25]，與表1的結果相符。

2.5 GA對BHb發光基團的影響

在BHb中有多種能夠產生內源性熒光的氨基酸殘基，其不利于進一步了解小分子化合物對蛋白質內部結構的影響。同步熒光光譜可以提供發色基團分子附近微環境變化的信息，具有靈敏度高、選擇性好的特點，被廣泛用于研究配體和蛋白質之間的相互作用[15,28]。本研究利用同步熒光光譜技術將圖2A中相互重疊的芳香族氨基酸殘基的熒光峰分離，以便了解氨基酸微環境的變化。如圖4所示，當Δλ=15 nm時，291 nm附近顯示的是酪氨酸(Tyr)殘基的熒光峰(圖4A)；Δλ=60 nm時，279.5 nm附近可觀察到色氨酸(Trp)殘基的熒光峰(圖4B)。

圖4 不同濃度沒食子酸與牛血紅蛋白相互作用的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of BHb in the presence of GA with various concentrations.注：0→8：在298 K條件下，3×10-6 mol/L BHb分別與0、1.0×10-5 mol/L、2.0×10-5 mol/L、3.0×10-5 mol/L、4.0×10-5 mol/L、5.0×10-5 mol/L、6.0×10-5 mol/L、7.0×10-5 mol/L、8.0×10-5 mol/L GA相互作用。

由圖4可知，隨著GA濃度的增加，BHb的酪氨酸殘基和色氨酸殘基發生猝滅，熒光強度逐漸降低，最大熒光發射峰發生位移；酪氨酸殘基的最大發射峰由291 nm紅移至293.5 nm處，熒光強度由36.16 a.u.下降至24.74 a.u.，發射峰紅移2.5 nm，熒光強度降低了11.42 a.u.；色氨酸殘基的最大發射峰由279.5 nm紅移至280.5 nm處，熒光強度由113.5 a.u.下降至95.07 a.u.，發射峰紅移1 nm，熒光強度降低了18.43 a.u.。酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光發射峰位發生位移，說明二者所處環境的疏水性降低、極性增加，肽鏈的延伸程度增加，蛋白質結構松弛；色氨酸殘基熒光強度的下降程度大于酪氨酸殘基，這表明GA和色氨酸殘基之間的相互作用更強，GA與BHb分子的結合位點更接近于色氨酸殘基而非酪氨酸殘基[25,29]。

2.6 利用傅里葉變換紅外光譜技術檢測GA對BHb二級結構的影響

傅里葉變換紅外(Fourier transform infrared，FTIR)光譜通常用于表征化學鍵和官能團，可以檢測BHb(3×10-6mol/L)在GA(8×10-5mol/L)作用下的結構變化[16]。如圖5所示，圖5中a與b分別為GA與BHb作用前后的FTIR光譜，其中，a顯示在1 656 cm-1、1 537 cm-1、1 385 cm-1和1 241 cm-1譜帶，分別為BHb主鏈肽鍵產生的酰胺I帶、酰胺II帶、酰胺IV帶和酰胺V帶；而b中相應的譜帶分別出現在1 658 cm-1、1 541 cm-1、1 395 cm-1和1 251 cm-1處。

酰胺I帶是肽鏈C=O的伸縮振動，其間的1 651～1 658 cm-1是α-螺旋結構的特征峰帶[18]。BHb與GA相互作用前后，在酰胺I帶的特征譜帶出現特征峰，說明BHb在GA作用前后均以α-螺旋結構為主；BHb與GA作用后，BHb的特征峰

圖5 牛血紅蛋白與沒食子酸作用前(a)后(b)的FTIR光譜圖Fig.5 FTIR spectra of BHb in the absence (a) and presence (b) of GA.

并未發生明顯的改變，因此說明BHb與GA作用后，并未改變BHb的化學結構[30]。總體來看，GA與BHb相互作用后，BHb的二級結構仍以α-螺旋結構為主。

2.7 利用圓二色光譜技術檢測GA對BHb二級結構的影響

BHb是一種以α-螺旋結構為主的蛋白質，觀測其二級結構的變化可以進一步確定GA對BHb結構的影響。圓二色光譜(circular dichroism，CD)技術作為一種靈敏的光譜技術，常用于溶液中蛋白質二級結構的研究[17]。在蛋白質與藥物分子相互作用時，其可用于監測蛋白質的二級結構變化。

由圖6中的a可知，BHb在靠近194 nm處有1個正的吸收峰，在209 nm和222 nm處表現為2個負的Cotton吸收峰，這是以α-螺旋結構為主的蛋白質所具有的CD光譜特征；209 nm譜帶對應的是α-螺旋結構的π-π*躍遷帶，222 nm譜帶是α-螺旋和無規則卷曲結構的π-π*躍遷帶[18]。與GA作用后，如圖6中的b、c所示，BHb的3個吸收峰強度均減弱，但峰形和峰位并未發生變化。因而可推斷BHb與GA相互作用前后都以α-螺旋結構為主。

圖6 不同濃度沒食子酸與牛血紅蛋白作用前(a)后(b,c)遠紫外圓二色光譜Fig.6 Far-UV CD spectra of BHb in the presence of GA with various concentrations.注：a: BHb，濃度為3×10-6 mol/L；b: BHb-GA, 其中GA濃度為2×10-5 mol/L；c: BHb-GA，其中GA濃度為8×10-5 mol/L。

利用定量分析程序CDNN對圖6的數據進行定量分析，擬合185～260 nm波長范圍內的CD數據，結果如表3所示。BHb的二級結構含量：α-螺旋含量為83.4%，β-折疊含量為2.3%，轉角含量為9.0%，無規則卷曲含量為8.6%。在與不同濃度GA相互作用后，可以看出BHb的α-螺旋結構的含量減少，β-折疊、轉角、無規則卷曲等結構的含量均增加，且GA濃度的增加，加劇了這種趨勢。

表3 牛血紅蛋白與不同濃度沒食子酸作用前后二級結構的含量Table 3 Fractions of secondary structure of BHb in the absence and presence of GA with various concertrations.

綜上所述，BHb與GA的相互作用使BHb的α-螺旋結構含量減少，β-折疊、轉角、無規則卷曲等結構的含量均增加，但α-螺旋結構仍為主要結構。在骨架氫鍵、疏水作用力和范德華力等力的驅動下，螺旋結構與側鏈熵呈逆向關系[14]。所以，BHb在與GA相互作用后α-螺旋結構含量減少的現象說明，側鏈熵增加，蛋白質穩定性下降，這與FTIR光譜檢測結果一致。BHb在與GA相互作用后，BHb的α-螺旋結構變得疏松，二級結構發生一定程度的變化，導致BHb熒光猝滅[5]。

3 討論

通過紫外-可見光譜、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜和圓二色光譜等手段，在pH 7.0條件下對GA和BHb的相互作用進行了研究。研究表明，GA與BHb的相互作用，結合常數的數量級為103～104，小于其他小分子化合物和蛋白質的結合常數，結合類型為動態結合，能自發發生反應，發生結合的主要作用力為疏水作用力，兩者的結合位點數只有1個，且結合位點更接近于色氨酸殘基而非酪氨酸殘基。GA可動態猝滅BHb的內源性熒光，擾動芳香族氨基酸所處的微環境，使分子內部的酪氨酸、色氨酸所處微環境發生改變，色氨酸殘基受到的影響比酪氨酸殘基大。GA對BHb分子的二級結構影響較小，反應前后均以α-螺旋結構為主。

總體而言，GA不會與BHb生成穩定的復合物，也不會引起BHb發生脫氧作用，對BHb蛋白的結構影響較小。這為GA在醫藥領域中的應用以及發揮其止血抑菌、抗腫瘤功能的小分子提供了理論基礎，同時，對于GA在生物相關領域如藥物代謝動力學、毒理學、藥理學和生物化學等方面的研究提供了參考依據。