青蒿MYB類轉錄因子AaBPF1的克隆及功能研究

馬嘉偉, 王宇婷, 嚴振寧, 付雪晴, 趙靜雅

上海交通大學農業與生物學院, 交大-復旦-諾丁漢植物生物技術研發中心, 上海 200240

瘧疾是由瘧原蟲引起的影響人類健康的傳染病，染上瘧疾會引起頭痛、發熱等一系列癥狀的出現，若情況繼續惡化，則可能導致昏迷甚至死亡[1]。2017年，全球瘧疾感染2.19億例，因瘧疾死亡人數為43.5萬人[2]。青蒿(ArtemisiaannuaL.)，又名黃花蒿，是一年生草本植物，莖直立、葉互生、地上部分多分枝，原產于中國，是我國傳統的中草藥，廣泛分布于全國各地[3]。1972年，我國研究人員從青蒿中分離得到抗瘧有效單體青蒿素，這一發現引起了全球科學家的廣泛關注；1981年，屠呦呦等[4]的研究表明青蒿素是一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物。世界衛生組織(World Health Organization，WHO)推薦使用青蒿素聯合療法(artemisinin-based combination therapies，ACTs)以減少瘧疾死亡人數[5]。此外，研究報道青蒿素及其衍生物還具有抗病毒[6]、抗癌[7]和抗血吸蟲[8]的作用。目前，市場上青蒿素的生產主要來源于植物提取，但是青蒿素含量較低，僅為葉片干重的0.01%～1%[9]。盡管酵母半合成青蒿素已經取得了成功，但其生產成本高，每年的生產量遠不能滿足全球青蒿素的需求量[10]。因此，利用植物代謝工程手段提高青蒿中青蒿素的含量是十分必要的。

圖1 青蒿素生物合成途徑Fig.1 Biosynthetic pathways of artemisinin in A. annua.注：FPS：法尼基焦磷酸合酶；ADS：紫穗槐-4,11-二烯合成酶；CYP71AV1：紫穗槐-4,11-二烯氧化酶；CPR：細胞色素還原酶；ADH1：乙醇脫氫酶1；DBR2：青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶；ALDH1：乙醛脫氫酶1。

青蒿素合成途徑已經基本解析清楚，如圖1所示，青蒿素合成前體物質異戊烯基二磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)及其異構體二甲基烯丙基二磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)分別來源于2種途徑：在胞質中發生的甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑和在質體中發生的2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-enthritol-4-phosphate，MEP)途徑[11]。法尼基焦磷酸(famesyl pyrophosphate，FPP)是青蒿素生物合成的直接底物，由IPP和DMAPP在法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase，FPS)的催化下生成。青蒿的分泌型腺毛是合成青蒿素的部位，青蒿素就儲存在蠟質囊腔中[12,13]。從FPP開始的一系列催化反應屬于青蒿中青蒿素特有的合成代謝途徑。FPP在紫穗槐-4,11-二烯合成酶(amorpha-4,11-diene synthase，ADS)的催化下生成紫穗槐二烯，這是進入青蒿素特異代謝途徑的第一步重要反應[14,15]。然后在紫穗槐-4,11-二烯氧化酶(amorpha-4,11-diene 12-hydroxylase，CYP71AV1)及其配體細胞色素還原酶(cytochrome P450 reductase，CPR)和乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)的作用下，紫穗槐二烯氧化水解生成青蒿酸[16]。在青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶(artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase，DBR2)與ALDH1的催化下形成二氫青蒿酸[17,18]。而青蒿酸轉化為青蒿素B和二氫青蒿酸轉化為青蒿素的過程是非酶促光氧化過程[19,20]。

轉錄因子是一類能夠特異結合基因的啟動子從而調控基因表達的蛋白質分子，如蘋果(Malusdomestica)轉錄因子MdMYB1可以與MdCOP1s互作，并通過直接結合花青素合成酶基因MdUFGT和MdDFR啟動子以調控花青素的合成[21]。目前的研究也證明了轉錄因子廣泛地參與了青蒿素的生物合成過程。在青蒿中，屬于AP2/ERF轉錄因子家族的AaORA能夠調控ADS、CYP71AV1和DBR2的表達水平從而提高青蒿素的生物合成[22]。本課題組從青蒿中克隆了AabZIP1轉錄因子，研究發現AabZIP1能夠直接結合ADS和CYP71AV1的啟動子，通過促進ADS和CYP71AV1基因的表達來調控青蒿素的合成[23]；同時還克隆了1個受茉莉酸誘導的bHLH家族的轉錄因子AaMYC2，其可通過與CYP71AV1和DBR2的啟動子結合影響青蒿素的合成[24]。而屬于WRKY轉錄因子家族的AaGSW1不僅受到AabZIP1和AaMYC2的直接調控，還能夠結合CYP71AV1和AaORA的啟動子從而通過多條路徑實現對青蒿素合成的調控[25]。MYB類轉錄因子家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，廣泛參與植物的生長發育以及代謝過程。然而，目前對青蒿中MYB類轉錄因子的研究相對較少，只有Matías-Hernández等[26]在青蒿中克隆了AaMYB1，當在青蒿中過表達AaMYB1基因時，多個青蒿素合成途徑的關鍵酶基因，尤其是ADS和CYP71AV1，基因表達量顯著提高，轉基因青蒿中青蒿素的含量也顯著提高。

光作為重要的環境因子之一，不僅為植物提供生存的能量，還影響植物的生長發育[27]。植物可通過光敏色素、隱花色素、向光素和紫外光受體接收光信號，并形成復雜的轉錄調控網絡響應光信號[28]。多項研究表明，光信號廣泛地參與了植物次生代謝產物的合成。Hong等[29]通過在青蒿中過量表達擬南芥(Arabidopsisthaliana)藍光受體AtCRY1基因顯著提高了轉基因青蒿植株中青蒿素的含量。本課題組前期研究發現，植物激素茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)促進青蒿素的合成是依賴于光的，在黑暗條件下MeJA處理后的青蒿幼苗中青蒿素合成酶基因ADS、CYP71AV1和ALDH1表達量并沒有提高[30]。Zhang等[31]使用不同光質處理青蒿幼苗，持續2 d后測定青蒿中的青蒿素及青蒿酸的含量，結果發現，與白光相比，紅光處理的青蒿幼苗積累了更多的青蒿素及青蒿酸。由此可見，紅光能夠促進青蒿素的合成，但是紅光調控青蒿素合成的機制尚未被揭示。

本研究通過對紅光處理6 h的青蒿轉錄組數據進行分析，篩選出MYB類轉錄因子AaBPF1，推測AaBPF1可能參與了紅光調控青蒿素的合成，并通過生物信息學分析、基因表達模式分析、Dual-luciferase系統檢測以及轉基因植株中目的基因表達量、青蒿素含量分析等進行進一步的驗證，以期為揭示光調控青蒿素合成機制的研究奠定基礎，并為青蒿素代謝工程提供良好的候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗使用的所有青蒿種子均來自重慶，保存于交大-復旦-諾丁漢植物生物技術研究中心,本實驗使用的煙草為本氏煙草(Nicotianabenthamiana)。青蒿及煙草的生長條件：16 h光照、8 h黑暗，于24℃培養間進行培養。

KOD DNA聚合酶購于日本東洋紡績株式會社，Taq酶、PrimeScriptRTreagent kit(Perfect Real Time)試劑盒購自大連TaKaRa公司，植物總RNA提取試劑盒、SuperReal PreMix Plus定量試劑盒均購于天根生化科技(北京)有限公司，Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒購于普洛麥格(北京)生物技術有限公司，Axygen膠回收試劑盒、Axygen質粒提取試劑盒購于康寧生命科學(吳江)有限公司，非連接酶依賴型單片段快速克隆試劑盒(ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit)購于南京諾唯贊生物科技有限公司，Gateway系統(美國Invitrogen公司)。

1.2 實驗儀器

Mastercycler nexus PCR儀(德國艾本德股份公司)，PTC-200 Peltier Thermal Cycler熒光定量PCR儀(伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)，Water alliance 2695液相分析儀(沃物世科技(上海)有限公司)，ELSD蒸發光散射檢測器(美國奧泰科技有限公司)。

1.3 轉錄組測序和基因表達分析

選取14 d左右、生長一致的青蒿幼苗置于黑暗中預處理24 h，隨后轉入40 μmol/m2·s的紅光條件下繼續培養6 h。各取3份處理0 h和6 h的青蒿葉片(5株青蒿幼苗混樣)用于轉錄組測序，并對測序數據進行拼接和注釋。

收集青蒿植株的不同組織(根、莖、幼葉、老葉和花蕾)，迅速置于液氮中，研磨至粉末后提取RNA，并利用PrimeScriptRTreagent kit(Perfect Real Time)試劑盒將其反轉錄成cDNA。根據實時熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR)引物設計原則，在非保守域設計基因特異性引物(引物序列見表1)，擴增產物約150～300 bp，選擇青蒿β-actin作為qRT-PCR內參基因，以cDNA為模板進行qRT-PCR分析。反應體系：cDNA模板3 μL，2×SuperReal PreMix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O補至20 μL。反應程序：94℃ 10 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 2 min，共40個循環。

1.4 AaBPF1基因克隆和載體構建

根據轉錄組數據庫中AaBPF1拼接序列設計基因特異性引物(引物序列見表1)，用KOD plus DNA聚合酶進行擴增。PCR反應體系：cDNA模板1 μL，AaBPF1-F 1.5 μL，AaBPF1-R 1.5 μL，dNTPs 5 μL，MgCl22.5 μL，10×KOD Plus Buffer 5 μL，ddH2O補至50 μL。反應程序：94℃ 10 min；94℃ 20 s，55℃ 20 s，68℃ 2 min，共40個循環；68℃ 10 min。取PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，利用Axygen膠回收試劑盒回收目的片段，并與pJET載體連接，轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，將陽性菌液交至鉑尚生物技術(上海)有限公司測序。

通過網站(http://web.expasy.org/translate/)獲得AaBPF1氨基酸序列，利用Conserved Domain Database(CDD)預測核苷酸結合域(nucleotide-binding domain，NBD)。利用特異性引物BamHI-AaBPF1-F及AaBPF1-SpeI-R擴增AaBPF1片段(PCR反應體系及程序參照KOD plus DNA聚合酶擴增)，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit將該片段連接到pHB-YFP載體BamHⅠ和SpeⅠ酶切位點上，以構建過量表達載體。再利用特異性引物Topo-AaBPF1-F、Topo-AaBPF1-R擴增部分AaBPF1片段(PCR反應體系及程序參照KOD plus DNA聚合酶擴增)，利用Gateway系統(Invitrogen公司)構建pHellsgate12-AaBPF1干擾載體，轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α，將陽性菌液交至公司測序。測序鑒定無誤后，利用Axgen質粒提取試劑盒抽提質粒，具體按照試劑盒說明書進行操作。所用引物序列見表1。將構建完成的過量表達載體和干擾載體轉化農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，用于青蒿遺傳轉化[32]。同時，將pHB-AaBPF1-YFP載體轉入農桿菌GV3101，采用農桿菌注射法侵染煙草葉片進行瞬時轉化，用于觀察亞細胞定位[33]。

表1 實驗所用引物序列Table 1 Primers used in this study.

注：下劃線為BamHⅠ和SpeⅠ的酶切位點。

1.5 Dual-luciferase實驗分析AaBPF1調控青蒿素合成

擴增ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1啟動子片段(PCR反應體系及程序參照KOD plus DNA聚合酶擴增，所用引物序列見表1)，利用ClonExpress II One Step Cloning Kit將PCR產物分別連接到載體pGREEN0800EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點上，與pSOUP18質粒共同轉化農桿菌GV3101。將含有啟動子和轉錄因子的農桿菌按照1∶1混合，用農桿菌注射法進行煙草葉片瞬時轉化，使用Dual-Luciferase?Reporter Assay System試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.6 青蒿的遺傳轉化及分析

用75%乙醇浸泡青蒿種子1 min，10%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水反復沖洗數次，將處理后的種子鋪在MS固體培養基上培養。幼苗長至5 cm左右時，剪下葉片與農桿菌共培養2 d，之后將外植體轉至發芽篩選培養基，在25℃、16 h光照/8 h黑暗的條件下培養2周，約3次繼代后，獲得潮霉素抗性的叢生芽，隨后挑選長勢良好的叢生芽剪下轉至生根培養基，生根后獲得再生青蒿植株，移至土壤中進行培養。

待轉基因青蒿生長2個月后，取其第一片葉提取RNA，反轉錄為cDNA后利用熒光定量PCR分析目的基因的表達量(引物序列見表1)，具體方法參照1.3中的基因表達分析。

取2個月大小的轉基因青蒿葉片于50℃烘箱中烘干，用研缽研磨成粉末，準確稱取0.1 g粉末，加入1 mL甲醇，30℃、50 W超聲30 min，12 000 r/min離心10 min后吸取上清液于2 mL離心管中；向沉淀中加入1 mL甲醇，再次超聲提取，離心后吸取上清液并與第一次上清液混勻，經0.45 μm過濾器過濾后進樣進行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分析。使用Water alliance 2695液相分析儀、Waters C18 色譜柱，測定青蒿素的流動相為甲醇∶水=60%∶40%(V/V)，測定二氫青蒿酸和青蒿酸的流動相為乙腈∶0.1%冰醋酸=60%∶40%(V/V)，流速均為1.0 mL/min；使用ELSD蒸發光散射檢測器檢測，載氣壓為5×105Pa，檢測器漂移管溫度設定為40℃。根據標準品計算出青蒿素在樣品干重中所占的比例。

1.7 數據分析

本研究使用TopHat軟件對轉錄組數據進行差異表達分析(http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml)。qRT-PCR的結果分析選擇Ct比較法，使用2-ΔΔCt方法進行數據計算與分析。所有圖中的誤差線(n=3)皆為標準差，且顯著性差異分析使用Student’st檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 紅光誘導的MYB類轉錄因子的篩選

將黑暗預處理后的青蒿幼苗置于40 μmol/m2·s 紅光下處理6 h后進行轉錄組測序，并對測序結果進行拼接注釋。將樣品的Unigenes的RPKM值均一化處理后篩選出差異基因，其中，青蒿素合成相關酶基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)的表達在紅光處理6 h后均上升(圖2A)。

MYB類轉錄因子是一類多功能的蛋白質家族，其參與了植物整個生命過程的調節，包括植物生長和發育的調節、光形態建成的調控、植物激素合成及信號傳導的調控等。通過差異分析，本研究篩選出紅光處理6 h后表達上升的3個MYB類轉錄因子(contig009201、contig007402以及contig003750；圖2A)。如圖2B所示，qRT-PCR進一步證明青蒿素合成酶基因、contig009201、contig007402和contig003750基因表達量在處理后6 h顯著高于0 h。結果表明contig009201、contig007402和contig003750很可能參與紅光調控青蒿素合成，因此，選擇這3個基因作為本研究的候選基因。

2.2 紅光誘導的MYB類轉錄因子基因的表達分析

青蒿素只在青蒿的分泌型腺毛中合成，青蒿素合成酶基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)的表達也具有組織特異性，均在花蕾中表達量最高，其次是幼葉[34]。qRT-PCR分析3個候選基因在不同組織中的表達情況，結果如圖3A～C所示，其中，contig009201在花蕾中表達量最高，其次是幼葉，在根和莖中的表達量較低。該表達模式與青蒿素合成酶基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)類似，而其他2個MYB類轉錄因子基因表達模式與之不同。因此，選擇contig009201作為本研究的目的基因。

圖2 受紅光誘導的MYB類轉錄因子的篩選Fig.2 Screening of MYB transcription factors induced by red light.注：A：轉錄組測序結果中青蒿素合成途徑中關鍵酶基因及篩選到的3個MYB類轉錄因子紅光處理后的基因表達；其中，綠色為低表達，顏色越深，代表表達量越高；紅色為高表達，顏色越淺，代表表達量越高。B：qRT-PCR驗證青蒿素合成途徑中關鍵酶基因及篩選到的3個MYB類轉錄因子紅光處理后的基因表達。0為紅光處理0 h；6 h為紅光處理6 h。

圖3 3個MYB類轉錄因子基因在青蒿不同組織中的表達量Fig.3 Relative expression of three MYB transcription factor genes in different tissues of Artemisia annua.

2.3 AaBPF1的克隆與分析

根據轉錄組測序結果設計特異性引物，以青蒿cDNA為模板擴增得到目的基因contig009201編碼區片段，命名為AaBPF1，其全長為1 932 bp，編碼643個氨基酸。使用pI/Mw工具(http://www.expasy.org)，可知該蛋白質的等電點為9.14，分子量為72.2 kDa。使用NCBI分析該序列發現該轉錄因子屬于MYB家族R3-MYB。多重序列比對顯示AaBPF1與長春花BPF同源性為56.1%，與歐芹BPF的同源性為55.4%(圖4A)。

AaBPF1的C端融合了黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)，從而形成AaBPF1-YFP融合蛋白。通過瞬時轉化煙草，利用激光共聚焦顯微鏡觀察AaBPF1的亞細胞定位。實驗結果表明AaBPF1定位于細胞核中(圖4B)。

2.4 AaBPF1與青蒿素合成的調控分析

將青蒿素合成酶基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)啟動子序列構建到Dual-luciferase系統(圖5A)，分別與AaBPF1過量表達載體瞬時轉化煙草，以驗證AaBPF1是否調控青蒿素的合成。如圖5B所示，Dual-luciferase系統檢測結果表明AaBPF1能夠顯著激活ADS和CYP71AV1基因的表達。

2.5 過量表達AaBPF1轉基因青蒿植株分析

通過農桿菌介導的遺傳轉化方法，獲得70棵抗性植株，PCR鑒定后獲得63棵AaBPF1過量表達轉基因青蒿植株。提取轉基因青蒿植株第一片葉RNA，反轉錄為cDNA，進行qRT-PCR分析，其中基因表達量最高的5個轉基因株系(BPF1-12、BPF1-22、BPF1-27、BPF1-44和BPF1-65)的結果如圖6A所示，轉基因植株中AaBPF1基因表達量顯著高于野生型對照，最高為野生型的18.8倍。隨后選擇這5個轉基因株系進行后續試驗(圖7A)。過量表達AaBPF1基因導致轉基因植株中ADS和CYP71AV1表達量顯著上調，而DBR2和ALDH1基因表達量也有所提高，可能是上游基因表達量提高使代謝流增加所致(圖6B)。HPLC

圖4 AaBPF1的生物信息學分析以及亞細胞定位Fig.4 Bioinformatics analysis and subcellular localization of AaBPF1.注：A：AaBPF1蛋白和其他植物BPF蛋白的比對，比對的BPF蛋白分別為長春花(CrBPF;CAC19789.1)及歐芹(PcBPF;CAA48413.1)，序列中高度保守的氨基酸用黃底表示，部分保守序列用藍底表示；B：AaBPF1在煙草葉片中的亞細胞定位。

圖5 AaBPF1調控青蒿素合成途徑中關鍵酶基因的表達Fig.5 Expression of artemisinin biosynthetic genes regulated by AaBPF1.注：A：Dual-luciferase實驗所使用載體系統；B：Dual-luciferase實驗結果。**表示實驗數據與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

圖6 過量表達AaBPF1轉基因青蒿植株分析Fig.6 Analysis of transgenic Artemisia annua plants with overexpression of AaBPF1.注：A：AaBPF1的基因表達；B：青蒿素合成途徑中關鍵酶基因的表達；C：轉基因植株中青蒿素的含量。CK為野生型植物(非轉基因植物)，其余為轉基因植株。*和**分別表示實驗組數據與CK相比差異達到顯著(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)。

圖7 轉基因青蒿植株Fig.7 Transgenic Artemisia annua plants.注：A：AaBPF1過量表達轉基因青蒿植株；B：AaBPF1 RNAi干擾轉基因青蒿植株。

測定青蒿素結果如圖6C所示，過量表達AaBPF1基因的青蒿中，青蒿素的含量最高約為18.4 mg/g (DW)，而對照組野生型青蒿中青蒿素的含量約為10.21 mg/g (DW)。上述結果證明，AaBPF1可能通過激活青蒿素合成酶基因的表達來正調控青蒿素的合成。

2.6 RNAi干擾AaBPF1轉基因青蒿植株分析

構建AaBPF1 RNAi干擾載體，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法，共獲得32棵AaBPF1 RNAi干擾轉基因青蒿植株。經qRT-PCR分析，其中基因表達量最低的5個轉基因株系(BPF1-RNAi-2、BPF1-RNAi-7、BPF1-RNAi-13、BPF1-RNAi-15和BPF1-RNAi-26)的結果如圖8A所示，可知轉基因青蒿中AaBPF1基因表達被顯著抑制。選擇這5個轉基因株系進行后續研究(圖7B)。抑制AaBPF1基因表達并未導致青蒿素合成酶基因(ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1)表達全部降低，僅有AaBPF1基因抑制效果最好的轉基因株系BPF1-RNAi-7的ADS、CYP71AV1和DBR2基因表達量顯著降低(圖8B)。轉基因青蒿BPF1-RNAi-7的青蒿素含量顯著低于野生型對照，其他轉基因株系青蒿素含量略低于野生型或與野生型植株無顯著差異(圖8C)。這可能是由于青蒿素調控網絡較為復雜，而AaBPF1很可能處于調控網絡的上游；此外，MYB類轉錄因子的功能冗余較多。

圖8 RNAi干擾AaBPF1轉基因青蒿植株分析Fig.8 Analysis of transgenic Artemisia annua plants RNAi silencing AaBPF1.注：A：AaBPF1的基因表達；B：青蒿素合成途徑中關鍵酶基因的表達 ；C：轉基因植株中青蒿素的含量。CK為野生型植物(非轉基因植物)，其余為轉基因植株。*和**分別表示實驗組數據與CK相比差異達到顯著(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)。

3 討論

光照除了可以通過光形態建成改變植物的形態結構，還能影響植物的次生代謝。一般情況下，較長波段的光(如紅光)，可以降低植物體內黃酮類物質的含量；短波段的光(如藍光)，有利于黃酮類物質的積累。如紅光處理會導致煙葉(NicotianatabacumL.)中黃酮的含量降低[35, 36]。但也有研究表明，遮蔭處理會讓高山紅景天(RhodiolasachalinensisA. Bor)根內積累的紅景天苷數量變少，而紅光處理下，高山紅景天根內積累的紅景天苷含量會升高[37]。此外，紅光處理還可以顯著增加番茄(Solanumlycopersicum)果實(著色期)中番茄紅素的含量[38]、丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)幼苗根系中丹酚酸B的含量[39]。在光調控植物次生代謝產物合成的研究中，MYB類轉錄因子備受關注。蘋果中花青素必須在光的參與下才能合成，從蘋果中克隆的MYB家族的MdMYB1、MdMYB10和MdMYBA均是受光誘導的轉錄因子，可調控花青苷合成關鍵基因的表達，在花青苷合成中發揮著重要作用[40,41]。將番茄置于強光下，番茄的R2R3MYB類轉錄因子SlAN1和SlAN2基因表達量顯著提高，從而促進花青素合成中關鍵基因的表達，使花青素在番茄苗中的合成和積累[42]。

本研究利用單色光紅光處理青蒿幼苗，并對測序所得的轉錄組數據進行差異基因分析和共表達分析，成功篩選到MYB類轉錄因子AaBPF1。Dual-luciferase系統檢測以及轉基因植株的目的基因表達、青蒿素含量分析的結果顯示，AaBPF1很可能是通過調節ADS和CYP71AV1基因的表達來實現對青蒿素合成的調控。通過已報道的對ADS和CYP71AV1啟動子序列的分析，發現這2個基因的啟動子區均具有MYB結合的順式作用元件[43,44]。因此，AaBPF1有可能是直接結合ADS和CYP71AV1啟動子調控其基因表達水平，從而調控青蒿素的合成；除此之外，AaBPF1也可能與其他轉錄因子(如bHLH類轉錄因子)通過蛋白相互作用，間接實現對ADS和CYP71AV1基因表達的調控。然而，AaBPF1的RNAi株系對青蒿素合成的影響并不明顯，這可能是由于青蒿素合成途徑調控網絡較為復雜且MYB類轉錄因子的功能冗余較多，因此造成AaBPF1的RNAi株系青蒿素含量變化不明顯。

MYB類轉錄因子的研究主要都集中在R2R3MYB，而R3MYB的功能研究相對較少。在已報道的R3MYB亞家族中，幾乎都是負調控因子[45]，因此，本研究發現的AaBPF1正調控次生代謝產物合成具有重要的意義，不僅是對紅光調控青蒿素合成機制的初步探索，也為青蒿素植物代謝工程提供了良好的候選基因。