ALDH2基因多態性與老年男性骨質疏松的相關性

劉菊 趙晟珣 陳輝

武漢市第一醫院老年病科，湖北 武漢 430022

流行病學調查顯示[1],我國骨質疏松發病率是 16.1%，其中男性發病率為11.2%，女性為 19.9%,而且隨著我國社會老齡化進程的不斷加速，發病率呈現出上升的趨勢，預計到 2020 年，我國骨質疏松患者將高達2.866 億[2]。

老年原發性骨質疏松癥可以引起骨質丟失，誘發骨折，嚴重影響患者的生活質量和預期壽命。在該病患者中，體內活性氧水平明顯增高，提示氧化應激在該病發生和發展中起重要作用[3]。乙醛脫氫酶 2(aldehyde dehydrogenase2, ALDH2)不僅是乙醇代謝過程中關鍵酶之一，而且是重要的抗氧化應激分子。目前ALDH2 對骨質疏松是否有影響的相關報道較少?？紤]女性患者受雌激素影響較大，本研究采用 DNA微陣列芯片法，對ALDH2 基因多態性與老年男性骨質疏松的相關性進行對比研究，以期探討 ALDH2基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)與骨質疏松的關系，為臨床早期進行干預性防治骨質疏松提供可靠的理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性調查: 收集武漢第一醫院老年科 2016 年 1 月至 2017年 11 月住院的老年男性人群(年齡≥65歲) 作為研究對象，共計 204 例，符合下列入選標準: 所有病例均排除嚴重腦血管病、急性心肌梗死、惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全、各種急性感染、影響骨代謝的疾病和服用影響骨代謝的藥物、手術或其他應激情況。將 204 例實驗對象隨機分為兩組: 第1組：符合 WHO 原發性骨質疏松癥診斷標準[4]，即雙能X線法檢測骨密度(Bone mineral density,BMD)T檢測值(T-score,)低于同性別、同種族健康成人的骨峰值2.5個標準差，除外繼發性骨質疏松癥老年男性患者(平均年齡 76.69±5.22) 117 例，作為原發性骨質疏松組 OP 組; 第2組：同期住院無骨質疏松癥,即BMD正常的老年男性人群(平均年齡 77.42±6.44) 87例，作為非骨質疏松癥組。

1.2 方法

1.2.1一般資料和生化指標測定：收集入選病例的年齡、測量身高、體重、計算體重指數(Body Mass Index,BMI)：體重(kg) /身高(m)2，測量收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)，記錄吸煙、飲酒情況，體檢者空腹、脫鞋去帽、穿單衣，采用統一的測量工具測量。采集空腹 8 h 以上的肘靜脈血，用奧林巴斯AU400 全自動生化儀檢測空腹血糖(Fasting blood-glucose，FBG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、C 反 應 蛋 白 (reactiveprotein,CRP)，運用酶聯免疫吸附(enzyme inkedimmunosorbent assay，ELISIA) 法檢測血清腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素 6(nterleukin-6，IL-6) 水平，其中 TNF-α試劑盒貨號為:LNF1-1081，IL-6試劑盒貨號為L6P1-1063。

1.2.2骨密度測定：應用法國 DMS 公司生產的雙能 X 線骨密度測定儀檢測腰椎前后位BMD，自動測出的T值，骨密度檢測人員是經過專門培訓的同一個技術人員， 骨密度分析系統可自動獲得 BMD 結果。

1.2.3ALDH2基因 SNP 檢測：(1)實驗材料：DNA提取純化試劑盒(BST01051)、免疫顯色試劑盒(BST03021)、ALDH2基因檢測試劑盒(DNA 微陣列芯片法)，國食藥監械(準)字 2016 第 3402573 號、全自動雜交儀(BR-526-24)、生物芯片識讀儀(BE-2.0)、基因芯片圖像分析軟件(Arraydoctor2.0)(上海百奧科技股份有限公司)；離心機(上海嘉鵬科技有限公司，TGL-16B標配轉 1.5*12)；PCR儀 [杭州博日科技有限公司，TC-96/G/H(b)B]。

(2)檢測過程：按照采血、提取DNA、擴增、雜交、芯片掃描五個步驟完成，整個檢測過程由武漢市第一醫院藥學部個體化實驗室完成。靜脈采血 2 mL，加至 EDTA抗凝管中，并充分混勻，用 DNA 提取純化試劑盒提取基因組 DNA，DNA 濃度為10 ～ 60 ng/μL- 1，從 ALDH2基因檢測試劑盒中取出擴增液進行擴增，反應體系為 25 μL， PCR 反應條件為：50 ℃ 5 min；94℃5 min；94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35 個循環；72 ℃ 5 min；PCR 產物 2 ～ 8 ℃保存。從免疫顯色試劑盒中取出雜交試劑、雜交試管(含預雜交液、洗液Ⅰ、洗液Ⅱ、洗液Ⅲ)、抗體和顯色液，進行雜交，雜交程序：預雜交液 42 ℃ 5 min；雜交 42 ℃ 30 min；洗液Ⅰ 42 ℃ 12 min；洗液Ⅱ 28 ℃ 10 min；抗體28 ℃ 20 min；洗液Ⅱ 28 ℃ 10 min；洗液Ⅲ 28 ℃ 3 min；顯色液 42 ℃ 30 min；預雜交液 28 ℃ 4 min。芯片晾干后放入 BE-2.0 生物芯片識讀儀中進行掃描，軟件提取各點的信號強度，進行數據分析，自動輸出基因型結果。

1.3統計分析

2 結果

2.1 兩組患者病程、生化及BMD的T值比較見表1

表1兩組病程、生化及BMD的T值比較

Table1Comparison of course of disease, biochemical index, and bone mineral density T-score between the two groups

組別骨質疏松組非骨質疏松組病程(年)7.14±0.656.88±0.77BMI (kg /m2)25.78 ± 3.0624.69±2.94SBP mmHg)135.42 ±12.46132.78±10.96DBP mmHg)8.39±9.0270.14±9.82FBG (mmol /L)5.44 ±1.255.62±1.41LDL-C (mmol /L)3.25±1.162.98±1.01T-值-3.08±1.04?-0.88±0.23

注: 與非骨質疏松組比較，*P<0.05。

Note: Compared with the non-osteoporosis group,*P<0.05.

2.2 基因測定結果的判定， ALDH2 基因型掃描見圖1。

117 例骨質疏松患者基因野生型(GG)：45 例，占 38.4%；基因突變雜合型(GA)：62例，占 53.0%；基因突變純合型(AA)：10 例，占8.6%。87 例無骨質疏松患者基因野生型(GG)：54 例，占 62.1%；基因突變雜合型(GA)：29例，占 33.3%；基因突變純合型(AA)：4例，占4.6%。ALDH2 基因型分布符合 Hardy-Weinberg 平衡。見表2。

圖1 ALDH2 基因型掃描野生型純合子GG 型:Glu(504)Glu；突變型雜合子GA 型:Glu(504)Lys； 突變型純合子AA 型:Lys(504)LysFig.1 Screening of the ALDH2 genotype

表2 Hardy-Weinberg平衡檢驗結果 (n)Table 2 Hardy-Weinberg equilibrium test results (n)

2.3 兩組ALDH2 基因型和等位基因頻率分布

兩組AA型 /GA型、GG 型頻率分布差異有統計學意義(P=0.001)。兩組間總的等位基因頻率分布差異有統計學意義(P=0.004)。骨質疏松組患者AA/GA 基因型頻率為61.6%；A 等位基因頻率為35.0%，均顯著高于無骨質疏松組(分別為37.9%，21.3%) (均P< 0.05)見表 3。

表3 兩組 ALDH2 基因多態性基因型和等位基因頻率的分布 [% (n) ]Table 3 ALDH2 gene polymorphism genotype and allele frequency distribution in the two groups (%, n)

2.4 兩組炎癥因子水平的比較見表4

表42組炎癥因子水平的比較

Table4Comparison of inflammatory cytokines between the two groups

炎癥因子骨質疏松組非骨質疏松組F值P值CRP8.46±1.262.62±0.846.846<0.05TNF-α6.41±0.785.02±0.696.463<0.05IL-61.86±0.440.98±0.364.592<0.05

3 討論

骨質疏松是一種慢性代謝性骨病，該病受多種因素的影響，如激素水平、年齡、血糖、環境、基因等，有報道稱骨質疏松46%～62%由遺傳因素決定，38%～54%取決于周圍環境因素[5]。ALDH2是一種線粒體酶，它具有脫氫酶和酯酶等多種酶功能，是酒精代謝關鍵酶，能將乙醛氧化為乙酸，同時還能氧化四羥基壬烯醛(4-HNE)和丙二醛(MDA)等醛類物質，發揮間接抗氧化作用，使其轉化為無毒的相應酸，從而損傷抗醛類和自由氧對細胞[6]。ALDH2 其第 12 位外顯子內的 G(鳥嘌呤)發生點突變為 A(腺嘌呤)，會使酶催化活性下降甚至喪失。ALDH2 在人群中有三種組合方式：野生型 GG；突變雜合型 GA；突變純合型 AA。ALDH-2 失活可使醛類物質和自由氧在體內堆積，進而損傷機體組織、器官等，且損傷是不可逆性的。

ALDH-2 活性下降，可能通過不能清除內皮祖細胞(EPCs)內脂質過氧化產物，增加EPCs 內自由氧水平，從而激活氧化應激的相關信號通路，破壞了線粒體的膜電位，減弱了 EPCs的功能，使其凋亡增加。氧化應激是由氧自由基特別是活性氧的產生與抗氧化處理自由基的能力不平衡而產生，進而造成對細胞的氧化損傷。孫振雙等[7]報道活性氧在線粒體中積累增加，造成氧化應激，通過Wnt/β-catenin 信號通路，降低成骨細胞形成、增殖與分化，最終導致骨質疏松。本文結果顯示，骨質疏松組中AA/AG 基因型頻率和A 等位基因頻率均顯著高于無骨質疏松組 (均P<0.05)，與上述研究結果一致，考慮A等位基因可能是老年男性骨質疏松發病的危險因素。臨床中，我們也發現不勝酒力、飲酒容易臉紅的人，因骨質疏松癥導致骨折的風險較高，可能也與ALDH-2基因突變引起活性下降有關。故對于GA和AA型人群，應該更加注意營養均衡、避免不健康的生活方式和口服影響鈣代謝的藥物等，以減少骨質疏松的發生。

同時由于激活氧化應激，導致中性粒細胞炎性浸潤，增加了蛋白酶的分泌，產生了大量氧化中間產物，增加了細胞因子和趨化因子的釋放，破壞了機體穩態平衡，造成器官、組織損傷。TNF-α與IL-6主要由 T 淋巴細胞產生，有學者認為[8]， TNF-α可能通過結合基質細胞(stromal cells)上的TNF-α受體，使基質細胞分泌RANKL、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimu-lating factor, M-CSF)和 IL-1等促進破骨細胞形成并激活細胞因子，同時能抑制破骨細胞凋亡，延長破骨細胞生存時間。表達 IL-6 的轉基因老鼠表現出骨量減少，皮質骨和松質骨的微結構被破壞，成骨細胞數量和活力下降，而骨吸收增強。CRP 既是炎癥介質，又是反映炎癥的非特異性敏感指標，Leftheriadis等[9]對腎病血透患者進行與骨轉換相關的慢性炎癥因子研究，發現其 CRP明顯高于健康者。而 DingC 等[10]通過研究發現老年人循環血液中CRP水平升高可導致全身、脊柱和髖部的骨密度下降。多種炎癥因子可能在骨質疏松發生發展中起到了重要作用，本研究結果也表明：骨質疏松組的炎癥因子水平明顯高于非骨質疏松組，且差異有統計學意義。

綜上所述，ALDH2 基因多態性與老年男性骨質疏松之間具有一定的相關性，ALDH2 基因突變可能使老年男性罹患骨質疏松的風險升高。但本研究的病例數較少，且ALDH2 基因突變增加老年人罹患骨質疏松的風險，是否通過氧化應激和增高炎癥因子水平的機制來實現的，還需要擴大樣本量進行進一步研究。