電針對去卵巢大鼠Wnt3a和β-catenin的基因及蛋白表達的影響

王亞軍 張來舉 浪萬英 宋亞文 宋凱

甘肅中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，甘肅 蘭州 730000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是隨著年齡的增長或婦女絕經(jīng)后，由成骨細胞和破骨細胞承擔的骨形成活動和骨吸收活動之間的平衡被打破，骨吸收超過骨形成而引起的以骨量減少、骨強度降低、骨脆性增加為特征，并伴隨骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化的全身代謝性骨病[1-3]。PMOP早期無明顯癥狀，故不會引起患者的注意，是一種易被人們忽視的隱性、慢性的流行性疾病[4-5]，隨著社會的老齡化，PMOP發(fā)病率和骨折率呈上升趨勢，本疾病引起的骨痛、骨骼變形及并發(fā)癥嚴重影響老年人的身體健康和生活質(zhì)量，PMOP的危害及防治已成為當今熱點問題之一[6]。以往，研究者認為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的首要原因是由于雌激素水平的下降[7-8]，但近年來已有越來越多的實驗研究結(jié)果表明，骨免疫異常、慢性炎性反應(yīng)、骨髓微循環(huán)障礙以及氧化應(yīng)激等也可導致PMOP，提示PMOP的發(fā)病機制是多靶點、多因素、多維度的，不再單純以雌激素為中心，最終，無論何種機制都是通過影響成骨細胞和破骨細胞的來源、分化增殖、凋亡及其功能而實現(xiàn)的。然而，任何干預手段最終均通過調(diào)節(jié)相關(guān)的信號傳導通路發(fā)揮治療作用，針灸療法亦如此[9]。近年來，針灸療法在治療PMOP的臨床和實驗研究中取得了一定進展，并以其安全簡便、無不良反應(yīng)和療效顯著等優(yōu)點而日益受到重視，但在療效評價和治療機制方面仍存在許多未解決的問題[10-11]。本實驗通過觀察電針對去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠Wnt3a和β-catenin的蛋白及基因表達的影響，探討針刺干預后Wntβ-catenin信號傳導通路的變化規(guī)律，闡明針刺是否通過調(diào)節(jié)這一信號通路系統(tǒng)達到治療的目的，以期從分子水平揭示針刺對PMOP的治療機制，為針灸治療PMOP的臨床應(yīng)用提供科學實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取60只SPF級雌性SD大鼠，日齡60 d左右，體質(zhì)量180 g～220 g，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度50%～70%，飲用純凈水，食用標準鼠類飼料，由甘肅中醫(yī)藥大學科研動物實驗中心提供[許可證號：SCXK(甘)2011-0001]，實驗動物質(zhì)量合格證編號：62001000000276。按隨機數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組、模型組、藥物組、針刺組，各12只。

1.2 主要儀器、試劑、針具及藥物

實時熒光定量PCR儀(ABI，美國)；相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)；鋸式切片機(Leica公司，德國)；Wnt3a一抗(Abcam，美國)；Beta-catenin(Abcam，美國)；免疫組織化學染色二抗試劑盒(博士德公司)；Total RNA提取試劑盒、Prime ScriptTM reagent逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Prime Ex TapTM ⅡPCR 試劑盒均購自TakaRa公司；引物由大連寶生物公司設(shè)計并合成；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，生產(chǎn)批號：199A3)；水合氯醛(保定市凌業(yè)商貿(mào)有限公司，生產(chǎn)批號：G3045)；針灸針(Ф0.35×13 mm，蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))；電針儀(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司，型號SDZ-Ⅱ)。

1.3 實驗方法

1.3.1骨質(zhì)疏松模型建立:按照文獻[12]方法造模:將模型組、藥物組、針刺組大鼠以10%水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，腹位固定，在其最末肋骨下，腋中線與距脊柱外側(cè)約1 cm交叉處備皮、消毒，切開皮膚約1～1.5 cm，依次切開肌肉，剪開腹膜進入腹腔，用小鑷子輕輕將白色發(fā)亮脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，便可見到粉色菜花樣卵巢，先將卵巢下端輸卵管用絲線結(jié)扎，然后摘除雙側(cè)卵巢，觀察無異常后，切口分層縫合，外部敷以消炎粉。空白組不做任何處理，假手術(shù)組只暴露雙側(cè)卵巢但不切除。造模后飼養(yǎng)13周，經(jīng)骨密度和骨礦物含量檢測，結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松模型建立成功，見表1。

分組nBMDBMC空白組120.176±0.00919.38±0.031模型組120.151±0.011?17.83±0.026▲

注：與空白組比較:*P<0.05；▲P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。

Note: Compared with the blank group,*P<0.05,▲P<0.05.

1.3.2干預方法:針刺組選取“腎俞”、“脾俞”、“三陰交”、“足三里”，穴位定位參照《實驗針灸學》[13]類比取穴，將大鼠穴位局部剪去鼠毛，穴位和針具常規(guī)消毒后，用0.35×13 mm不銹鋼毫針快速刺入皮下一定深度，接入電針儀，頻率為2 Hz，斷續(xù)波，刺激強度1.0mA，以局部見肌肉輕微收縮為佳[14-15]，每次電針刺激15 min，1次/1 d，連續(xù)治療5 d，間隔2 d，20 d為1個療程，治療3個療程，同時灌服與藥物組相同體積的蒸餾水；藥物組大鼠給予1 mL/100 g體質(zhì)量的0.02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液灌胃(給藥劑量按照大鼠體表面積比值折算而成)[12,16]，療程同針刺組；空白組不予處理，常規(guī)飼養(yǎng)；假手術(shù)組和模型組大鼠灌服與藥物組相同體積的蒸餾水，療程同針刺組。各組大鼠每周稱重1次，以此調(diào)整給藥劑量。治療期滿3個療程后采用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉并處死各組大鼠，分離出股骨和脛骨，剝除附著的軟組織，用經(jīng)生理鹽水浸透的醫(yī)用紗布包裹左側(cè)脛骨和右側(cè)股骨，放置于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.4 指標檢測與方法

1.4.1RT-PCR分析法檢測Wnt3a和β-catenin mRNA表達:(1)總RNA提取：將新鮮的右側(cè)股骨加入液氮，研磨至粉末后，家兔Trizol裂解液室溫放置5～10 min使細胞充分裂解后，加入250 μL預冷過的氯仿，蓋上離心管蓋，用手劇烈震蕩20 s后室溫放置5 min左右，12000rpm 4 ℃離心15 min，此時樣品分為三層，取最上一層上清液(注意別吸到蛋白層)，加入400 μL異丙醇，輕輕上下顛倒混勻15次，室溫放置30 min左右。12000 rpm 4 ℃ 離心15 min，得到白色沉淀，棄上清后沿離心管壁加入75%的乙醇1 mL進行沉淀的清洗，12000 rpm 4 ℃離心5 min。棄上清，室溫干燥沉淀2～5 min后溶解沉淀，紫外分光光度計檢測所提取的RNA溶液在260 nm、280 nm、320 nm的吸光值，計算RNA純度及濃度。

(2)總mRNA的逆轉(zhuǎn)錄：逆轉(zhuǎn)錄過程根據(jù)Prime ScriptTM reagent逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進行，PCR擴增體系為1步PCR，37℃15 min，最后85℃5 s使酶變性失活，然后4 ℃保存10 min。引物的設(shè)計與合成由寶生物(大連)公司完成。

Wnt3a： F 5’-AAAGCACGGTGTTGGG -3’；R 5’-CAGAGGATTCGGGATC -3’

β-catenin： F 5’-CGGTTAGAAGGGGTTA-3’；R 5’-GACGGTCTCGGTGTGT-3’

GAPDH：F 5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’；R 5’-CTGTGCCGTTGA ACTTGC-3’

(3)PCR檢測：實時熒光定量PCR過程按照TakaRa Prime Ex TapTM ⅡPCR 試劑盒操作說明進行。PCR反應(yīng)條件：第一步95 ℃預變性30 s；第二步95 ℃變性5 s，第三步60 ℃退火40個循環(huán)，每個循環(huán)31 s，最后進行溶解階段。所有結(jié)果經(jīng)GAPDH內(nèi)參校正后，ΔΔCt法計算最終結(jié)果并采用2-ΔΔCt表示。

1.4.2免疫組化法檢測Wnt3a和β-catenin 蛋白表達

(1)切片：將新鮮凍存的左側(cè)脛骨置于飽和EDTA溶液中進行脫鈣，20天后，檢測脫鈣效果；將脫鈣后的骨組織進行脫水，石蠟包埋后，切片，組織厚度不超過50 μM；將制備好的切片進行脫蠟至水；沸水浴5 min進行抗原修復；透膜：加入0.02% TritonX-100 10 min，PBS清洗3次，5 min/次。

(2)免疫組織化學染色：封閉：PBS清洗3次，5 min/次，加入3%H2O210 min，PBS清洗3次，5 min/次，加入5% 胎牛血清(FBS)封閉1 h；孵育一抗：吸掉FBS，加入一抗，4 ℃過夜；孵育二抗：PBS清洗3次，5 min/次，加入二抗，37 ℃培養(yǎng)箱孵育0.5 h；PBS清洗3次，5 min/次，加入SABC 37 ℃ 培養(yǎng)箱孵育0.5 h；顯色：PBS清洗2次，5 min/次，加入DAB顯色劑，顯色1～5 min，出現(xiàn)棕黃色即可；復染：蒸餾水清洗2次，5 min/次，蘇木素復染1 min，蒸餾水漂洗，加入鹽酸酒精，立即洗掉，蒸餾水清洗15 min；脫水封片：分別浸入80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯各1 min，脫水，樹脂封片至干凈載玻片，光學顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨Wnt3a mRNA表達水平

如圖1所示，模型組Wnt3a mRNA表達量最低,與空白組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經(jīng)藥物或針刺干預后，Wnt3a mRNA表達顯著升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 各組大鼠Wnt3a 蛋白表達與模型組比較，**P<0.05Fig.3 Protein expression of Wnt3a in each group Compared with model group,**P<0.05

圖1 各組大鼠Wnt3a mRNA相對表達量與模型組比較，**P<0.05Fig.1 The relative mRNA expression of Wnt3a in each group Compared with model group,**P<0.05

2.2 各組大鼠股骨β-catenin mRNA表達水平

如圖2所示，模型組β-catenin mRNA表達量最低,與空白組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經(jīng)藥物或針刺干預后，β-catenin mRNA表達顯著升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 各組大鼠β-catenin mRNA相對表達量與模型組比較，**P<0.05Fig.2 The relative mRNA expression of β-catenin in each group Compared with model group,**P<0.05

2.3 各組大鼠脛骨Wnt3a 蛋白表達水平

如圖3所示，模型組Wnt3a 蛋白表達量最低,與空白組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經(jīng)藥物或針刺干預后，Wnt3a 蛋白表達顯著升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 各組大鼠脛骨β-catenin蛋白表達水平

如圖4所示，模型組β-catenin蛋白表達量最低,與空白組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經(jīng)藥物或針刺干預后，β-catenin蛋白蛋白表達顯著升高，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 各組大鼠β-catenin蛋白表達與模型組比較，**P<0.05Fig.4 Protein expression of β-catenin in each group Compared with model group,**P<0.05

3 討論

關(guān)于PMOP的中醫(yī)病因病機及辨證分型由于缺乏經(jīng)典理論的指引，臨床上尚缺乏統(tǒng)一的診斷標準，歷代醫(yī)家多認為其與腎、脾、肝、瘀密切相關(guān)，基本病機是脾腎虧虛、骨枯髓痿為本、邪阻經(jīng)絡(luò)為標，肝失疏泄是關(guān)鍵，血瘀是其促進因素，當以補腎健脾疏肝，輔以通絡(luò)為治療原則[17]。中醫(yī)理論認為，腎主骨藏精，腎精對骨的發(fā)生、成長及退化起著重要作用；脾主四肢，為百骸之母，氣血生化之源，脾化生精微借助于腎陽的溫煦，而腎中精氣依賴于水谷精微的充養(yǎng)，二者相互資養(yǎng)，互為因果，脾虛可導致腎虛及骨髓空虛，從而引起PMOP的發(fā)生。脾俞、腎俞具有健脾補腎的作用，三陰交為肝脾腎三經(jīng)的交會穴，可補益三臟之虛，足三里，為胃之下合穴有健脾和胃、扶正培元、通經(jīng)活絡(luò)、升降氣機的功效，為全身強壯要穴，諸穴相配可有效改善PMOP的臨床癥狀，從而達到較好的治療效果。

現(xiàn)代醫(yī)學認為，PMOP發(fā)病機制是由成骨細胞骨形成功能絕對或相對不足，破骨細胞骨吸收功能亢進，骨吸收超過骨形成而引起的。因此，西醫(yī)治療PMOP多采用骨形成促進劑和骨吸收抑制劑，包括雌激素類、降鈣素類、甲狀旁腺激素類、活性維生素D等[18]，上述治療方法雖有效果，但存在遠期療效欠佳、副作用多等不足。大量臨床實踐和實驗研究的結(jié)果表明，針刺能有效增加大鼠骨密度，阻止骨量降低，減緩骨力學的退變，增強骨強度[19-21]。為進一步從分子水平探討針刺治療PMOP的作用機制，本實驗以RT-PCR法和免疫組化技術(shù)檢測去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠Wnt3a和β-catenin基因和蛋白表達水平。結(jié)果顯示，模型組Wnt3a和β-catenin基因和蛋白表達水平均明顯低于空白組和假手術(shù)組(P<0.05)；補腎健脾穴位電針或戊酸雌二醇水溶液灌胃可明顯提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠Wnt3a和β-catenin基因和蛋白表達水平，提示W(wǎng)ntβ-catenin信號傳導途徑對成骨細胞分化增殖起著十分重要的作用。其中Wnt3a蛋白是Wntβ-catenin信號通路的起始因子,β-catenin是Wntβ-catenin信號通路中最關(guān)鍵因子[22]。 本實驗結(jié)果提示，針刺PMOP可能是通過上調(diào)Wnt3a和β-catenin的基因和蛋白表達從而調(diào)節(jié)Wntβ-catenin信號通路，以此調(diào)節(jié)骨重建系統(tǒng)的平衡，從而達到預防和治療PMOP的效果，該實驗結(jié)果為臨床針灸治療PMOP提供了科學的理論依據(jù)。

針灸的療效具有整體性、多維度、多靶點、多目標的調(diào)節(jié)作用的特點，隨著對針刺治療產(chǎn)生的全身的、整體的調(diào)節(jié)作用，深入探究以及現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù)方法的發(fā)展，對PMOP的認識已達到細胞分子水平，但仍有些問題值得思考：1.研究發(fā)展緩慢，一味地重復相同指標且研究層次較低，應(yīng)針對以往未涉及的實驗環(huán)節(jié)，如機制研究。2.研究治療周期較短，針灸對PMOP遠期療效尚不能確定，由于PMOP是一個長期形成的過程，治療也同樣需要長期的過程，因此，今后的研究可考慮采用更長的研究周期，這樣能更好地凸顯針刺的治療效果。3.治療PMOP方法繁雜多樣，新的治療方法不斷涌現(xiàn)，如何找到一種既突出本方法特色又對其特異性及所針對適應(yīng)證型規(guī)律性進行總結(jié)和概括的優(yōu)化治療方案，仍有待進一步探討。總之，針灸治療PMOP的研究任重道遠，有待向更系統(tǒng)、更深領(lǐng)域發(fā)展。