PBK/TOPK表達對膀胱癌BIU-87細胞增殖及遷移能力的影響

賈建民，段 堃，李 巖，趙 艷，夏 偉，吳 凡，葛永超

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生存健康，目前關(guān)于其發(fā)病機制仍不清楚[1-2]。由于在臨床中缺乏膀胱癌篩查及早期診斷的分子標志物，很多患者被確診時已進展為中晚期[3]。尋找膀胱癌有效的早期篩查及診斷分子標志物，仍需要依靠基礎(chǔ)研究的進展。PDZ連接激酶/T-LAK細胞源蛋白激酶(PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase，PBK/TOPK)為一種絲-蘇氨酸激酶，屬絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen activated protein kinase kinase，MAPKK)分子家族成員，目前研究表明其表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)[4-6]。在膀胱癌組織中發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK呈高表達[7]，PBK/TOPK表達是否影響膀胱癌BIU-87細胞的增殖及遷移能力，目前尚不清楚。本研究旨在進一步探討膀胱癌中PBK/TOPK的表達，及其表達對膀胱癌BIU-87細胞增殖和遷移能力的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月—2016年12月鄭州大學第五附屬醫(yī)院膀胱癌患者的手術(shù)切除標本，共40例，所有患者均經(jīng)病理學確診，其中男性30例，女性10例，年齡55～65歲，平均年齡62歲。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及生物免疫治療。癌旁組織為癌旁>3 cm的膀胱組織，所有新鮮標本均置于液氮中保存。

1.2 主要儀器與試劑 RNAiso PLUS(日本TaKaRa公司)，氯仿(南京化學試劑股份有限公司)，異丙醇(南京化學試劑股份有限公司)，紫外分光光度計(美國ABI公司，型號：photoLab 6100)，逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，7500 PCR儀(美國ABI公司，型號：ABI7500)，PBK/TOPK多克隆抗體(美國Abcom 公司)，單克隆甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(美國ABI公司)，膀胱癌BIU-87細胞株(上海銳聰實驗中心)，胎牛血清(南美hyclone公司)，DMEM(Dulbecco minimum essential medium，DMEM)必需培養(yǎng)基(上海中喬新舟生物科技公司)，CO2孵箱(濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，型號：BPX-250-Z/BPX-250-ZS/BPX-150-Z)，CCK-8(Cell Counting Kit 8)溶液(北京沃比森科技有限公司)，酶標儀(南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司，型號：DG5035A)，Transwell小室(北京明陽科華生物技術(shù)有限公司)，姬姆薩染色液(廈門海標科技有限公司)。

1.3 實時定量PCR(quantificational real time-PCR，qRT-PCR) 收集新鮮的膀胱癌及癌旁正常膀胱組織標本，加入液氮，研磨成粉末加入1 mL RNAiso PLUS充分裂解細胞，室溫靜置5 min。按照0.2 mL氯仿/1 mL RNAiso PLUS的比例加入氯仿，漩渦振蕩器上劇烈振蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃、12 000 rpm離心20 min，取上清液再加入等體積的異丙醇沉淀RNA，室溫靜置10 min后，4 ℃、12 000 rpm離心10 min，棄去上清，用焦碳酸二乙酯水溶解沉淀，于紫外分光光度計測定A260/A280，計算RNA的濃度，取A260/A280值為1.8～2.0進行后續(xù)實驗。

采用逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR試劑盒，嚴格按操作步驟進行，其中逆轉(zhuǎn)10 μL體系包括2 μL的5×PrimeScriptTMRT Master Mix、500 ng的RNA，加RNase-freed H2O至10 μL，逆轉(zhuǎn)條件為37 ℃15 min，85 ℃滅活15 s。上樣量為20μL體系[包括SYBR PremixEx TaqTMⅡ(2×)10 μL，上游引物及下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL]，于7500 PCR儀定量檢測。反應條件為95 ℃預變性34 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)，其中，PBK/TOPK上游引物序列為：5′-GAGAGTGGCTTTCACAATGGA-3′，下游引物序列為：5′-GGCCGGGATATTTATAGTTGGA-3′；內(nèi)參β-actin上游引物序列為：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物序列為：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAG AAGCA-3′，引物均由深圳華大基因有限公司設(shè)計合成。樣本均設(shè)3個復孔，以2-△△ct計算mRNA的相對表達量，即：△Ct=(目的基因-內(nèi)參基因)，△△Ct=△Ct患者-△Ct對照，以2-△△Ct作為目的基因的相對表達量。

1.4 免疫印跡實驗(Western Blot) 收集新鮮標本，加入液氮，研磨成粉末加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑，采用蛋白定量法測定蛋白濃度。以50 μg蛋白上樣于聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠2 h，再將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，封閉后滴加PBK/TOPK多克隆抗體(稀釋比例1∶1 500)和單克隆GAPDH抗體(稀釋比例1∶2 000)，置于4 ℃冰箱孵育過夜。Tris緩沖鹽水洗滌后，滴加二抗孵育1 h，采用增強型化學發(fā)光法定量檢測PBK/TOPK蛋白表達。

1.5 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 參見相關(guān)文獻[8]，將膀胱癌BIU-87細胞采用含15%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。實驗分為干擾組、對照組及過表達組，干擾組轉(zhuǎn)染特異性siPBK/TOPK干擾片段，對照組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，過表達組轉(zhuǎn)染外源性PBK/TOPK質(zhì)粒。siPBK/TOPK干擾片段為：5′-CCCUGAGGCUUGUUACAUUdTdT-3′，PBK/TOPK干擾片段、過表達質(zhì)粒及無關(guān)序列均由上海吉凱生物有限公司設(shè)計合成。

1.6 CCK-8細胞增殖實驗 胰酶消化細胞，調(diào)整細胞密度為2×104/mL，取100 μL細胞懸液鋪板于96孔板，鋪板后12 h，加入CCK-8溶液培養(yǎng)4 h，于酶標儀上測定細胞的光密度(optical density value，OD)值，波長設(shè)為570 nm，每組設(shè)5個副孔，連續(xù)觀察5 d。

1.7 Transwell細胞遷移實驗 胰酶消化細胞，調(diào)整細胞密度為2×105/mL，取500 μL細胞懸液加入Transwell小室的上室，同時加入500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基于小室的下室，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后，取出小室，用棉簽擦去Transwell上室內(nèi)未穿過濾膜的細胞，經(jīng)95%酒精固定后行姬姆薩染色液染色，在高倍顯微鏡下(20×)隨機取10個視野，統(tǒng)計遷移出Transwell上室的細胞數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 PBK/TOPK在膀胱癌組織中的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果表明：膀胱癌組織中PBK/TOPK mRNA表達水平明顯高于癌旁組織，差異比較具有統(tǒng)計學意義(t=12.324，P=0.000)；同時，Western Blot檢測結(jié)果顯示PBK/TOPK蛋白在膀胱癌組織中的表達也明顯高于癌旁組織，圖1。

圖1 qRT-PCR及Western blot檢測PBK/TOPK在膀胱癌組織中的表達

2.2 膀胱癌BIU-87細胞中PBK/TOPK表達的干擾及過表達 經(jīng)轉(zhuǎn)染PBK/TOPK干擾片段后，PBK/TOPK mRNA在膀胱癌BIU-87細胞中的表達明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=-62.191，P=0.000，表1)。同時，經(jīng)轉(zhuǎn)染PBK/TOPK過表達質(zhì)粒后，PBK/TOPK mRNA在膀胱癌BIU-87細胞中的表達明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=11.887，P=0.007，表2)；同時，Western Blot檢測結(jié)果表明經(jīng)轉(zhuǎn)染后PBK/TOPK蛋白均被成功地敲低及過表達，圖2。

表1 qRT-PCR檢測干擾后膀胱癌BIU-87細胞中PBK/TOPK mRNA的表達水平

表2 qRT-PCR檢測過表達后膀胱癌BIU-87細胞中PBK/TOPK mRNA的表達水平

2.3 PBK/TOPK表達對BIU-87細胞增殖及遷移能力的影響 CCK-8實驗結(jié)果表明干擾PBK/TOPK表達能明顯抑制BIU-87細胞的增殖，而PBK/TOPK過表達能明顯促進BIU-87細胞的增殖(圖3，P=0.000)。Transwell實驗結(jié)果表明干擾PBK/TOPK表達能明顯抑制BIU-87細胞的遷移(t=20.212，P=0.000)，而PBK/TOPK過表達能明顯促進BIU-87細胞的遷移(t=16.652，P=0.000)，圖4。

圖2 qRT-PCR及Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后PBK/TOPK在膀胱癌BIU-87細胞中的表達

圖3 PBK/TOPK表達與膀胱癌BIU-87細胞增殖的關(guān)系

A：PBK/TOPK干擾組細胞的遷移數(shù)(20×)；B：PBK/TOPK對照組細胞的遷移數(shù)(20×)；C：PBK/TOPK過表達組細胞的遷移數(shù)(20×)；D：細胞遷移數(shù)統(tǒng)計學分析圖4 PBK/TOPK表達與膀胱癌BIU-87細胞遷移的關(guān)系

3 討論

PBK/TOPK是一種絲-蘇氨酸激酶，首先由Gaudet等[4]于2000年在Hela細胞cDNA文庫中克隆出來，命名為PBK。隨后，Abe等[9]構(gòu)建T-LAK細胞cDNA文庫克隆出新型的蛋白激酶，命名為TOPK，然而通過序列分析發(fā)現(xiàn)TOPK與PBK為同一種分子，為此命名為PBK/TOPK。PBK/TOPK含有322個氨基酸，介導淋巴因子激活的殺傷T(T-LAK)細胞的細胞毒作用。由于PBK/TOPK缺少MAPKK家族中維持催化功能的重要結(jié)構(gòu)域，因此PBK/TOPK本身沒有催化活性，主要參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖及細胞周期中有絲分裂期的紡錘體形成，其異常表達具有強烈的細胞致癌潛能[5]。目前研究表明PBK/TOPK在多種惡性腫瘤中均呈高表達，如非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌及白血病等[10-13]。此外，Singh等[7]檢測了PBK/TOPK在65例膀胱癌組織中的表達，發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK陽性表達率為64.6%，其在肌層浸潤性膀胱癌中的表達明顯高于非肌層浸潤膀胱癌組織中的表達，提示PBK/TOPK表達可能有助于膀胱癌細胞的增殖及侵襲，然而仍缺乏可靠的實驗依據(jù)。因此，探討PBK/TOPK在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的生物學功能仍具有潛在的研究價值。

本研究結(jié)果顯示PBK/TOPK在膀胱癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，與相關(guān)報道一致[7]，進一步提示PBK/TOPK陽性表達與膀胱癌的發(fā)生有關(guān)，可能為膀胱癌的分子標志物。此外，通過干擾及過表達PBK/TOPK在膀胱癌BIU-87細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)干擾PBK/TOPK表達明顯抑制了膀胱癌細胞的增殖及遷移，而PBK/TOPK過表達能明顯促進膀胱癌細胞的增殖及遷移。這些結(jié)果提示PBK/TOPK在膀胱癌中具有調(diào)控細胞增殖及遷移的能力，可能會影響膀胱癌患者的病情進展。同時，在非小細胞肺癌、乳腺癌及白血病中發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK表達也有助于腫瘤細胞的增殖[10,14-15]，與本研究結(jié)果較為一致，均提示PBK/TOPK表達有助于腫瘤細胞的增殖。此外，PBK/TOPK表達與口腔癌及肺癌患者的預后相關(guān)[10,16]，然而，PBK/TOPK表達是否會影響膀胱癌患者的預后，目前仍不清楚，有待進一步研究。

目前，關(guān)于PBK/TOPK在膀胱癌中的作用機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)PBK/TOPK在乳腺癌中能通過激活p38及MAPK信號通路促進細胞的增殖[17]。在肺癌中，TOPK/PBK能通過PI3K/PTEN/AKT信號通路促進細胞的遷移[18]。然而，PBK/TOPK促進膀胱癌細胞增殖及遷移的機制是否與p38、MAPK及PI3K/PTEN/AKT信號通路有關(guān)仍不清楚，有待于進一步的深入研究。